Biologia Molecular Hibridização de AC.Nucléicos Heloisa Arantes Thaise Akahoshi

Hibridização A hibridização geralmente refere-se a uma técnica biológica molecular que determina o grau de semelhança genética entre combinações de sequências de DNA.

Hibridização Compara uma amostra identificada depois que é hibridizada. DNA das duas espécies; é extraído, purificado e cortado em pequenos pedaços (por exemplo 600 a 800 par de bases). O DNA de um organismo é identificado para serem comparados um com o outro. A união fica incubada para permitir que as cadeias de DNA se separem e se restabeleçam formando um DNA híbrido de dupla-hélice.

Hibridização de Ac.nucléicos Utilização de sondas que permite caracterizar e identificar DNA, baseando-se nas propriedades do mesmo;(DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA). Importante para analisar genes expressos e genes não expressos. A visualização destes genes de interesse dá-se pelo emparelhamento das sondas que se encontram marcadas por radioatividade, por quimioluminescência ou por um anticorpo.

Hibridização de Ac.nucléicos •Como identificar o clone de interesse numa biblioteca genômica? Hibridização: DNA/DNA , antígeno- anticorpo (sonda molecular); •Como identificar a expressão de um gene? Hibridização DNA/RNA;

Hibridização de Ac.nucléicos Southern blotting: análise de DNA •Northern blotting: análise de mRNA •Western blotting: análise de proteina

Southern blotting E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana Detecta polimorfismo de DNA ou mutação

Southern blot Permite a detecção de fragmentos de DNA. Nesta técnica o DNA é digerido com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados por electroforese em gel de agarose. Após a desnaturação e transferência do DNA para uma membrana, híbrida-se com uma sonda apropriada e visualiza-se os resultados. O Southern-blot é utilizado para diagnósticos moleculares.

SOUTHERN BLOTTING Etapas: Extração do DNA Digestão do DNA Preparo da Sonda Transferência Hibridização Detecção

Northern Blot Semelhante ao Southern: Utiliza RNA e não DNA Não utiliza reações de restrição Difere no procedimento do Southern blot: adição de formaldeído no gel de agarose, que funciona como um desnaturante. Como no Southern blot, a sonda hibridizadora pode ser feita de DNA ou RNA.

Metodologia Isolar RNA total das células. Separar RNA de cada amostra por eletroforese em gel. Transferência de RNA para uma membrana. Hibridização com sonda radioativa Exposição a filme de raio X

Western Blot Método para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose), onde foram usados como sonda anticorpos específicos à proteína. Com o resultado, pode-se examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.

Método de execução do Western Blot Preparação do tecido; Eletroforese em gel; Transferência; Bloqueio; Detecção ●Método de dois passos: Anticorpo primário; Anticorpo secundário. ● Metodo de um passo 6. Detecção ● Detecção colorimétrica; ● Quimioluminescência; ● Detecção radioativa; ● Detecção fluorescente 7. Sondagem secundaria 8. Analise ‘

2.7- Western Blot: Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

Aplicações em diagnósticos médicos ● O teste confirmatório de HIV emprega um Western Blot para detectar o anticorpo anti-HIV na amostra de soro humano. Proteínas de células conhecidas infectadas com o HIV são separadas e "blotadas" em uma membrana. Então, no soro a ser testado é aplicado o anticorpo primário no passo de incubação; o anticorpo livre é lavado, e um anticorpo anti-humano secundário é ligado, e uma enzima reveladora é adicionada. As bandas impregnadas então indicam os anticorpos do soro dos pacientes marcados com o anticorpo anti-humano. ● Um Western Blot também é um teste definitivo para a doença da vaca louca. ● Algumas formas do teste da Doença de Lyme empregam o Western Blot.

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