Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Funções das proteínas Vagalume Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP

Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Os aminoácidos Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L Carbono alfa Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L A biologia é canhota Glicina não tem isomeria óptica

Grupo R apolar e alifáticos Aminoácidos apolares e hidrofóbicos Ligações de Van der Waals Ala, Val, Leu, Iso Interações hidrofóbicas Gly; menor aminoácido Met Possui átomo de enxofre Pro Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromáticos Aminoácidos hidrofóbicos Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água Modificações pós- traducionais Fosforilação do OH da tirosina Fenilalanina Mais apolar

Grupos R polares, não carregados Solubilidade intermediária em água Serina e treonina Grupos hidroxil Asparagina e glutamina Grupo amida Cisteína Grupo sulfidril Ligações dissulfeto

Grupos R carregados Aminoácidos básicos Aminoácidos ácidos Carga positiva Lisina, segundo grupo amino Arginina, grupo guanidina Histidina, grupo aromático imidazol Aminoácidos ácidos Carga negativa Possuem segundo grupo ácido carboxílico

Aminoácidos incomuns Modificações pós-traducionais Selenocisteína 4-hidroxiprolina 5-hidroxilisina 6-N-metil-lisina Gama-carboxiglutamato Fosforilação de resíduos Selenocisteína Selênio ao invés de enxofre na Cys É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado

pH e pKa Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas Ionização < pH; > [H]+ estado não-ionizado

Aminoácidos são ionizáveis Substâncias anfóteras: possuem natureza dual Podem funcionar assim como ácidos ou bases Doam ou recebem prótons

Titulação de um aminoácidos pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

Peptídeos tbm são ionizáveis Ou seja, possuem curva de titulação característica Funcionam em faixas de pH ótimas

Número de resíduos por proteína

Uso de aminoácidos Varia bastante entre as proteínas Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

Proteínas com outros grupos químicos Adicionados pós-traducionalmente

Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Proteínas podem ser separadas e purificadas Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? Basta selecionar por propriedade Tamanho, carga e propriedades de ligação Obter o extrato bruto “correr” em cromatografia de coluna Fase estável (matriz) Fase móvel (solução com tampão) Coluna maior permite maior resolução na separação

Cromatografia por troca iônica Polímero carregado negativamente Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna Afinidade da proteína é definido também pelo pH

Cromatografia por exclusão de tamanho Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

Cromatografia de afinidade Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz Elui-se com solução de ATP

Eletroforese -- Histórico 1952, Markham and Smith Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico 1955, Smithies Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel

Eletroforese Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme DNA, carga negativa Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas Preparação do gel Aplicação das amostras Coloração Análise dos resultados

Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel Aplicação do campo elétrico Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão Terminais positivo e negativo Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

Coloração das moléculas Prata Gel SDS-PAGE PoliAcrilamide Gel Electrophoresis Melhor resolução Coomassie blue, etc Brometo de etídio Agente intercalante do DNA Cancerígeno! Composto fluorescente à luz UV Gel de agarose

Eletroforese de um resultado de cromatografia

O marcador de peso molecular Comprado de uma empresa Possui proteínas de peso molecular bem conhecido Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

Geis bidimensionais Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra Maiores géis dão maiores resolução

Proteínas não separadas podem ser quantificadas Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa Deve-se poder medir o produto da ação enzimática Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Níveis estruturais das proteínas

As estruturas primárias das proteínas são conhecidas Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas E principalmente dentro da mesma

Sequenciamento de peptídeos Degradação de Edman Marca e remove apenas o resíduo N-terminal Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

Produção de peptídeos Purificação a partir de tecidos Engenharia genética Síntese química direta

Alinhamento de sequências Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) Derivam do ancestral comum entre os organismos O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

Evolução molecular Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

Árvore molecular da vida

Conclusões Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra