Cinética Enzimática Prof. Dr. Henning Ulrich

Influência do Substrato Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação; Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S  P; Velocidade inicial (V0): [S] >> [E]  tempo muito curto  [S] = constante.

Influência do Substrato [E] = cte  [S] = V0  linear  [S] = V0  V0 = Vmáx

Influência do Substrato Alguns casos a V0 não pode ser medida Não existe técnica experimental; Equação química não representa a transformação; Velocidade da reação: Velocidade média de consumo ou produção; Variação de uma propriedade no sistema.

Influência do Substrato Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES  passo obrigatório; Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) E combina-se reversivelmente com S ES k1 E + S ES k-1 ES se rompe  E e P k2 ES E + P

Influência do Substrato Qualquer instante da reação: E e ES; [S]  = velocidade da reação  [S]; Vmáx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES  enzima “saturada”;  [S]: estado pré-estacionário   ES; Estado estacionário  [ES] = cte; V0  estado estacionário.

Equação Michaelis-Menten Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; Hipótese: limitante  quebra de ES  E + P.

Equação Michaelis-Menten Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a [S] inicial relacionadas através de Km.

Equação Michaelis-Menten Relação numérica: V0 é metade de Vmáx; km = “afinidade” pelo substrato;  Km  afinidade Vmáx é proporcional à [E].

Significado de Km e Vmáx Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; Mecanismos de reação diferentes  catalisam reações com 6 ou 8 passos; Significado e magnitude de Vmáx e Km varia; Km: depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.

Significado de Km e Vmáx K2 << K-1  afinidade da enzima; K2 >> K-1; K2 e K-1 são comparáveis a Km  função complexa; Vmáx: número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.

Significado de Km e Vmáx K1 K2 K3 E + S ES EP E + P K-1 K-2 Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et]; Kcat = velocidade limitante de qualquer reação  enzimas saturadas; Kcat e Km = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.

[ES] = [ET] [S] / Km + [S] Constante de Michaelis Complexo enzima-substrato: ES v (formação) = k1 [S] [E] { v (“degradação”) = k-1[ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES] Estado estacionário (“steady state”): [ES] = constante v de formação = v de “degradação” ou: k1 [S] [E] = (k-1 + k2) [ES] [S] [E] / [ES] = (k-1 + k2) / k1 { (k-1 + k2) / k1 = Km Constante de Michaelis [ES] = [S] [E] / Km { [E] = [ET] – [ES] { [ES] = ([ET] – [ES]) [S] / Km [ES] = [ET] [S] / Km – [ES] [S] / Km {[ES] + [ES] [S] / Km = [ET] [S] / Km ([ES] Km + [ES] [S]) / Km = [ET] [S] / Km { [ES] (Km + [S]) / Km = [ET] [S] / Km [ES] = [ET] [S] / Km + [S]

v / k2 = Vmax / k2 ( [S] / Km + [S] ) [ES] = [ET] ( [S] / Km + [S] ) [ES] = v / k2 [ET] = Vmax / k2 v / k2 = Vmax / k2 ( [S] / Km + [S] )

Constante de Michaelis: KD aparente de ES. Variável dependente: velocidade de reação, função de [S]. Constante*: velocidade máxima Variável independente: concentração do substrato. Constante de Michaelis: KD aparente de ES. * “Constante”: Vmax é função de [E]total

Parâmetros Cinéticos Exemplo: 0,25 0,78 0,51 1,25 1,03 1,66 2,52 2,19 [S] (g/L) Vo (g/L.h) 0,25 0,78 0,51 1,25 1,03 1,66 2,52 2,19 4,33 2,35 7,25 2,57

Parâmetros Cinéticos Exemplo: Lineweaver-Burk

Inibidores Competitivos Forma estrutural = substrato  competição; Porcentual de inibição  concentrações e afinidade pela enzima.

Inibidores Competitivos  [S]  Vmáx = Km  Experimento 1º  [E], [S] = cte 2º  [E], [I] = cte 1/V0 x 1/[S]

Inibidores Competitivos Equação de Michaelis e Menten Lineweaver-Burk

Inibidores Competitivos Relação entre as velocidades com e sem inibidor [S]  = influência do [I] desprezível.

Inibidores Não-Competitivos Ocupa outro sítio  ES, EI e EIS; [S]  = não leva todas as E  produtiva; Vmáx  e Km normal.

Inibidores Não-Competitivos Equação da velocidade: Lineweaver-Burk

Inibidores Incompetitivos Bloqueio de ES; 2 sítios ativos  I se fixa no complexo ES; ESI = não forma P; Vmáx  e Km 

Inibidores Incompetitivos Equação da velocidade: Lineweaver-Burke:

Inibidores Incompetitivos

Inibidores Irreversíveis Combinam-se com um grupo funcional  destruição; União covalente  inibidor e enzima. Vmáx  e Km =

Inibidores Irreversíveis Equação de Michaelis e Menten:

Inibidores Irreversíveis Lineweaver-Burk:

Influência do pH Valor de pH ótimo = atividade máxima; Velocidade da reação:  pH afasta do ótimo; Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis; Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H+.

Influência do pH HA  A + H+ pH   HA   A  Aminoácidos: pH   -COO- captam prótons = -COOH; pH   -NH3+ são dissociados = NH2; Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.

Influência do pH pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis  estrutura primária; Variações do pH  afeta substrato com grupos ionizáveis; Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.

Influência do pH pH 5 e 8 = não afeta a atividade; Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; 5 > pH > 8 = inativação irreversível.

Influência da Temperatura  T   velocidade de reação =  energia cinética; T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio  alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação  pouco acima da T ótima.

Influência da Temperatura Enzimas  PM  1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; Substratos protegem a enzima da desnaturação.

Influência da Temperatura K é função  da T  Lei de Arrhenius

Influência da Temperatura Enzimas são termolábeis  reação enzimática = inativação términa Efeito da T na velocidade das reações  coeficiente de temperatura Velocidade  quando a T  10ºC.

Regulação da Atividade Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima  substrato da enzima subseqüente; Enzimas reguladoras  determina a velocidade da seqüência; Atividade catalítica  ou   sinais; Moléculas sinalizadoras  pequenos metabólitos ou cofatores.

Enzimas Alostéricas Ligação não-covalente e reversível  modulador; Inibição por retroalimentação Enzima reguladora  inibida pelo P final da via  reequilibra as necessidades celulares; Moduladores: inibidores ou estimuladores.

Enzimas Alostéricas Modulador = substrato  homotrópicas; Modulador  substrato  heterotrópicas; Sítio alostérico  específico para o modulador; Curva de saturação sigmóide  subunidades múltiplas.

Enzimas Alostéricas  curvas de variação de atividade  moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

Modificação Covalente Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura; Metabolismo alterado  aciona vias inativas e inibem vias ativas.