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Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi.

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1 Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

2 Funções das proteínas Vagalume – Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP

3 Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

4 Os aminoácidos Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L – A biologia é canhota Glicina não tem isomeria óptica Carbono alfa

5 Grupo R apolar e alifáticos Aminoácidos apolares e hidrofóbicos Ligações de Van der Waals Ala, Val, Leu, Iso – Interações hidrofóbicas Gly; menor aminoácido Met – Possui átomo de enxofre Pro – Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

6 Grupo R aromáticos Aminoácidos hidrofóbicos Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água Modificações pós- traducionais – Fosforilação do OH da tirosina Fenilalanina – Mais apolar

7 Grupos R polares, não carregados Solubilidade intermediária em água Serina e treonina – Grupos hidroxil Asparagina e glutamina – Grupo amida Cisteína – Grupo sulfidril – Ligações dissulfeto

8 Grupos R carregados Aminoácidos básicos – Carga positiva – Lisina, segundo grupo amino – Arginina, grupo guanidina – Histidina, grupo aromático imidazol Aminoácidos ácidos – Carga negativa – Possuem segundo grupo ácido carboxílico

9 Aminoácidos incomuns Modificações pós-traducionais – 4-hidroxiprolina – 5-hidroxilisina – 6-N-metil-lisina – Gama-carboxiglutamato – Fosforilação de resíduos Selenocisteína – Selênio ao invés de enxofre na Cys – É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado

10 pH e pKa Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas Ionização [H] + estado não-ionizado

11 Aminoácidos são ionizáveis Substâncias anfóteras: possuem natureza dual Podem funcionar assim como ácidos ou bases – Doam ou recebem prótons

12 Titulação de um aminoácidos pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

13 Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

14 Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

15 Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY CN

16 Peptídeos tbm são ionizáveis Ou seja, possuem curva de titulação característica Funcionam em faixas de pH ótimas

17 Número de resíduos por proteína

18 Uso de aminoácidos Varia bastante entre as proteínas Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

19 Proteínas com outros grupos químicos Adicionados pós-traducionalmente

20 Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

21 Proteínas podem ser separadas e purificadas Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? – Basta selecionar por propriedade Tamanho, carga e propriedades de ligação Obter o extrato bruto – “correr” em cromatografia de coluna Fase estável (matriz) Fase móvel (solução com tampão) – Coluna maior permite maior resolução na separação

22 Cromatografia por troca iônica Polímero carregado negativamente – Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna Afinidade da proteína é definido também pelo pH

23 Cromatografia por exclusão de tamanho Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

24 Cromatografia de afinidade Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz Elui-se com solução de ATP

25 Eletroforese -- Histórico 1952, Markham and Smith – Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico 1955, Smithies – Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel

26 Eletroforese Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

27 Eletroforese, etapas 1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese 4.Coloração 5. Análise dos resultados

28 Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

29 Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta

30 Corrida do gel Aplicação do campo elétrico Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão Terminais positivo e negativo Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

31 Coloração das moléculas Prata – Gel SDS-PAGE PoliAcrilamide Gel Electrophoresis – Melhor resolução Coomassie blue, etc Brometo de etídio – Agente intercalante do DNA Cancerígeno! – Composto fluorescente à luz UV – Gel de agarose

32

33 Eletroforese de um resultado de cromatografia

34 O marcador de peso molecular Comprado de uma empresa – Possui proteínas de peso molecular bem conhecido Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

35 Geis bidimensionais Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira- se-o e corre-se em outra dimensão Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra – Maiores géis dão maiores resolução

36 Proteínas não separadas podem ser quantificadas Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa Deve-se poder medir o produto da ação enzimática Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

37 Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

38 Níveis estruturais das proteínas

39 As estruturas primárias das proteínas são conhecidas Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas – E principalmente dentro da mesma

40 Sequenciamento de peptídeos Degradação de Edman – Marca e remove apenas o resíduo N-terminal Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

41 Produção de peptídeos Purificação a partir de tecidos Engenharia genética Síntese química direta

42 Alinhamento de sequências Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) – Derivam do ancestral comum entre os organismos O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

43 Evolução molecular Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

44 Árvore molecular da vida

45 Conclusões Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra


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