Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato

Apresentação em tema: "Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato"— Transcrição da apresentação:

1 Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato
Cristina Resende Diana Cruz T6

2 Objectivo Mapear a localização preferencial do VEGF (vascular endothelial growth factor) no pénis do rato Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo mapear e comparar a localização do factor de crescimento no pénis em diversos grupos de risco.

3 Histologia do pénis Componentes principais: Uretra
3 corpos cilíndricos de tecido eréctil 2 Corpos cavernosos - na parte dorsal Corpo esponjoso – anteriormente; a revestir a uretra Fig. 1: Corte transversal de pénis humano

4 Os corpos cavernosos são envolvidos por uma camada resistente de tecido conjuntivo denso - a túnica albugínea. O tecido eréctil que compõe os corpos cavernosos e o corpo esponjoso tem uma grande quantidade de espaços cavernosos separados por trabéculas de fibras de tecido conjuntivo e células musculares lisas. Fig. 2: Corte transversal de pénis humano (maior ampliação)

5 Fisiologia da erecção (I)
Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção Molécula sinalizadora parácrina Sintetizado a partir do aminoácido arginina Difunde-se directamente através da membrana plasmática das células alvo Molécula extremamente instável, com um tempo de semi-vida curto (alguns segundos)

6 Fisiologia da erecção (II)
Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso

7 Epidemiologia da disfunção eréctil
estudos epidemiológicos demonstram uma associação entre o envelhecimento e a disfunção eréctil declínio da actividade sexual e da função eréctil com o envelhecimento Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de idade.

8 associada a patologias concomitantes
doença aterosclerótica das artérias penianas principal causa da disfunção eréctil relacionada com a idade Disfunção eréctil não é necessariamente uma consequência inevitável da idade associada a patologias concomitantes Factores de risco vascular como hipertensão, hipercolesterolemia, tabaco e diabetes  associados a maior probabilidade de disfunção eréctil

9 Outros factores de risco:
declínio da produção hormonal, nomeadamente de androgénios Factores psicológicos Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica de patologias concomitantes

10 Importância do estudo Crescimento populacional
Última década  grande preocupação nesta área Crescimento populacional Aumento da esperança média de vida Acréscimo importante na prevalência de diversas patologias, incluindo a disfunção eréctil Compreensão mais aprofundada dos mecanismos fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à orientação de novas linhas terapêuticas

11 músculo liso cavernoso endotélio
Alterações estruturais e ultrastruturais nos componentes fibroelásticos das: trabéculas penianas, músculo liso cavernoso endotélio inadequada expansão sinusoidal rigidez do pénis erecto

12 Farmacologia para melhorar a erecção peniana
Medicamentos de acção periférica de actuação predominantemente vasoactiva como os inibidores da fosfodiesterase tipo 5 Viagra

13 Angiogénese terapêutica
1 dos factores responsáveis pela disfunção eréctil Disfunção endotelial Traduz-se em: desordens do fluxo arterial relaxamento do músculo liso cavernoso disfunção venooclusiva Alvo farmacológico válido na prevenção da disfunção eréctil

14 Neovascularização cavernosa é controlada por factores de crescimento angiogénicos que promovem a proliferação e migração de células endoteliais e musculares lisas VEGF um dos factores mais importantes, que ainda estimula a produção de óxido nítrico

15 VEGF Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais, estimulando a angiogénese Parente distante do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e factor de crescimento da placenta (codificados por genes distintos) Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais, musculares lisas e fibroblastos)

16 regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas
A administração intracavernosa de VEGF em modelo animal estimula a expressão da síntase de óxido nítrico endotelial, sendo a presença deste necessária para a angiogénese regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas Melhoramento da erecção peniana (numa situação de oclusão arterial aguda)

17 Utilização de modelos animais
O estudo da expressão de VEGF no animal experimental parece fundamental na regulação destes mecanismos Possibilidade de manipulação biológica, química e genética, simulando nestes animais os factores de risco para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in vivo  Extrapolações têm que ser cuidadosas

18 Imunocitoquímica Produto da reacção Anticorpo secundário
conjugado com uma enzima Anticorpo primário Célula com antigénio

19 Protocolo Imunocitoquímica:
1º Dia Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA). Recuperação antigénica em tampão de citrato Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen. Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS) Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC

20 Protocolo Imunocitoquímica:
2º Dia Adicionar Ab secundário (1/100) a TA Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA. Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes. Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina Desidratar e montar com Entellan

21 Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Resultados Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

22 Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

23 Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

24 Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)

25 Discussão dos resultados
Os corpos cavernosos apresentam marcação preferencial no tecido conjuntivo (sem definição específica). Este tecido apresenta as condições necessárias para a formação de vasos. O tecido muscular liso não apresenta marcação acentuada O endotélio apresenta alguma marcação. Uretra com marcação, mas no lúmen  contaminação (deficiência de lavagem)

26 Perspectivas futuras Estudos experimentais Fisiopatologia da erecção
Mecanismos de actuação terapêutica

27 Agradecimentos Dr. Pedro Vendeira Dr. Jorge Ferreira
Dra. Delminda Neves Serviço de Biologia Celular e Molecular

28 Bibliografia Williams and Warwick; GRAY’S ANATOMY; 38º Edição; Churchill Livingstone, 1995 Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. "Molecular Biology of the Cell." - 4th ed., New York, 2002. G.M. Cooper, AMS Press,. "The Cell. A Molecular approach."- 3th ed. U.S.A Kinsey A, Pomeroy W, Martin C: Sexual behavior in the human Male. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1948 Feldman H, Goldstein I, Hatzichristou D, et al: Impotence and its medical and phychosocial correlates: results of the Massachusetts Male Aging Study. J Urol 151: 54, 1994 Siroky M, Azadzoi K: Vasculogenic erectile dysfunction: newer therapeutic strategies. J Urol 170: S24, 2003 Penson D, Rajfer J, Gonzalez-Cadavid N: Androgen dependence of neuronal nitric oxide synthase content in the rat penis. Endothelium 3: S86, 1995 Liu X, Lin C, Graziottin T, et al: Vascular endothelial growth factor promotes proliferation and migration of cavernous smooth muscle cells. J Urol 166: 354, 2001 Murohara T, Asahara T, Silver M, et al: Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia, J Clin Invest 101: 2567, 1998