Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas.

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1 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas

2 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Genética Molecular em Medicina Transfusional Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

3  Métodos Baseados No Tm  Melting Profiles and GC clamps  DGGE PerpendicularPerpendicular ParaleloParalelo  CDGE  TTGE  Métodos Baseados na conformação  SSCP  HA  CSGE

4 “Melting Profiles” Vários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

5 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Gradiente de desnaturação  Químico  Temperatura O gradiente pode ser:  Perpendicular ao campo eléctrico  Paralelo ao campo eléctrico

6 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) heteroduplexes homoduplexes

7 Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

8 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão

9 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm

10 Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNA Conformação do dsDNA  não depende da sequência  A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos  A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA  depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

11 Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturado dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido dsDNA é diluido Renaturação rápida Renaturação rápida Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Resultado depende muito de:  Temperatura de corrida  Concentração de desnaturante  Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 WT2 mutantes

12 Heteroduplex Analysis (HA) Heterodupletos causam Heterodupletos causam  Distorção na conformação  Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Heterodupletos podem existir por:  Co-amplificação por PCR de heterozigotos  Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

13 Heteroduplex Analysis (HA) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

14 Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio: Principio:  Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Método:  Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)  Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros  Utilizar fragmentos com 300-800 bp

15 Hibridização desnaturar

16 Hibridização Adicionar sonda

17 Hibridização

18 Adicionar substracto

19 Dot-Blot

20 Variações Hibridização em microplaca Hibridização em microplaca hibridização reversa hibridização reversa

21 DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)

22 Inno-Lippa Hibridização em filtro Hibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Hibridização reversa Marcação no produto do PCR Marcação no produto do PCR

23

24 Resultados do INNO-LIPA

25 MEIA

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27 Southern Blot

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29 Northern Blot Semelhante ao Southern Semelhante ao Southern  Utiliza RNA e não DNA  Não utiliza reacções de restrição