RECICLAGEM DE VESÍCULAS SINÁPTICAS COM CONTEÚDO REDUZIDO Luciana Ferreira Leite1,3, Débora Lopes da Costa Oliveira1, Bento João da Graça Azevedo Abreu1,4, Cristina Guatimosim Fonseca1,2,4 Departamento de Morfologia1 do Instituto de Ciências Biológicas, UFMG, Belo Horizonte, MG, BRASIL. Orientadora2. Bolsista Fapemig3. Professor4 INTRODUÇÃO EXOCITOSE DE VESÍCULAS SINÁPTICAS COM CONTEÚDO REDUZIDO, EM JUNÇÃO NEUROMUSCULAR A liberação de neurotransmissores é etapa fundamental para a comunicação neuronal. Este processo ocorre por meio do ciclo de exocitose e endocitose de vesículas sinápticas. O acúmulo de neurotransmissores nas vesículas sinápticas depende do gradiente proto-eletroquímico, gerado pela acidifi-cação vesicular, produzida pela H+V-ATPase. Algumas substâncias podem interferir com o processo de aci-dificação vesicular. Cloreto de amônio e metilamina são bases fracas, capazes de romper o gradiente de pH, comprometendo o processo de preenchimento vesicular com neurotransmissor. A bafilomicina é um inibidor da H+V-ATPase, que impede a gera-ção do gradiente próton-eletroquímico. Neste trabalho, utilizou-se a sonda fluorescente FM1-43 para investigar o processo de reciclagem de vesículas sinápticas com conteúdo reduzido, em dois modelos experimentais: junção neu-romuscular e neurônio bipolar. METODOLOGIA FM1-43: - marcador fluorescente anfipático - liga-se à membrana - incorporado durante endocitose - liberado na exocitose Junção neuromuscular Marcação com FM1-43 após estímulo com KCl, com ou sem a substância testada Desmarcação após estímulo com KCl, com ou sem a substância testada Neurônio Bipolar Marcação com FM1-43, evocada por KCl, em meio sem Ca+2, com ou sem a substância testada evocada por KCl em meio com 2,5mM Ca+2, com ou sem a substância testada Figura 2: Exocitose de vesículas sinápticas com conteúdo normal ou reduzido, em junção neuromuscular. A: Fotodesmarcação (sem estímulo) por 30 minutos. B: Fluorescência antes e 30 minutos após exposição a 60mM de KCl. C: Fluorescência an-tes e 30 minutos após exposição a 60mM de KCl + 30mM de NH4Cl. D: Fluorescência antes e 30 minutos após exposição a 60mM KCl + 10M de Metilamina. E: Fluorescência antes e 30 minutos após exposição a e 60mM de KCl + 1M de Bafilomicina. F: Gráfico representativo da exocitose evocada por 60mM de KCl, 60mM de KCl + 30mM de NH4Cl, KCl + 10M de Metilamina e 60mM de KCl + 1M de Bafilomicina. Os resultados são a média e erro padrão da intensidade de desmarcação de 252 clusters de vesículas de 31terminações nervosas. Aumento das imagens = 63x. Barra de escala = 10 µm. ENDOCITOSE DE VESÍCULAS SINÁPTICAS COM CONTEÚDO REDUZIDO, EM NEURÔNIO BIPOLAR RESULTADOS ENDOCITOSE DE VESÍCULAS SINÁPTICAS COM CONTEÚDO REDUZIDO, EM JUNÇÃO NEUROMUSCULAR Figura 3: Endocitose de vesículas sinápticas com conteúdo normal ou reduzido em neurônio bipolar. A: Imagem representativa de terminais nervosos marcados com 4 µM FM1-43, na presença de 50mM de KCl +10mM Metilamina, em meio sem Ca+2 e 50mM de KCl + 10mM Metilamina, em meio com 2,5mM de Ca+2 (figuras supe-riores). Imagem representativa de terminais marcados com 4µM de FM1-43, na presen-ça de 50mM de KCl + 30µM de NH4Cl, em meio sem Ca+2, e 50mM de KCl + 30 µM NH4Cl, em meio com 2,5mM de Ca+2 (painel do meio). Imagem representativo da mar-cação com 4µM de FM1-43, evocada por 50mM de KCl +500nM de Bafilomicina, em meio sem Ca+2, e 50mM de KCl + 500nM de Bafilomicina, em meio com 2,5mM de Ca+2 B: Gráfico representativo da fluorescência de terminais nervosos expostos aos inibido-res do pH: Metilamina, NH4Cl e Bafilomicina. CONCLUSÃO Figura 1: Endocitose de vesículas sinápticas com conteúdo normal ou reduzi-do em junção neuromuscular. A: Terminal nervoso estimulado com 60mM de KCl, na presença de FM1-43. B: Terminal nervoso estimulado com 60mM de KCl + 30mM de NH4Cl, na presença de FM1-43. C: Terminal nervoso estimulado com 60mM de KCl + 10M de Metilamina, na presença de FM1-43. D: Terminal nervoso estimulado com 60mM de KCl + 1M de Bafilomicina, na presença de FM1-43. E: Gráfico representati-vo da endocitose evocada por 60mM de KCl, 60mM de KCl + 30mM de NH4Cl, 60mM KCl + 10M de Metilamina e 60mM de KCl + 1M de Bafilomicina. Os resultados são a média e erro padrão da intensidade de marcação de 1.110 clusters de vesículas de 237 terminações nervosas. Aumento das imagens = 63x. Barra de escala = 10 µm. A inibição da acidificação vesicular, provocada por NH4Cl e Metilamina, e da formação do gradiente próton-eletroquímico, pela Bafilomicina, não afeta a reciclagem de vesículas sinápticas em junção neuromuscular e neurônio bipolar. Estes resultados sugerem que não existe um mecanismo de regulação que impeça a reciclagem de vesículas com conteúdo reduzido de neurotransmissores . Fontes financiadoras: