Vera Regina Medeiros Andrade, 2015 Espermograma Procedimentos Analíticos Vera Regina Medeiros Andrade, 2015

Análise qualitativa e quantitativa não automatizada Avaliação da motilidade e vitalidade

Preparo para análise seminal Em uma lâmina, colocar 10 µl de sêmen e cobrir com uma lamínula de 22x22mm Repousar por alguns minutos Examinar em 10X e 40X Verificar o número de espermatozóides por campo

Aglutinação A sua presença pode sugerir causa imunológica de infertilidade Deve ser analisada em 10 campos A sua presença deve ser relatada, e o tipo de aglutinação registrado Cabeça-cabeça Cauda-cauda Peça intermediária – peça intermediária Mista (vários tipos presentes)

Motilidade Dever ser classificada nas seguintes categorias: Motilidade progressiva e rápida Motilidade progressiva lenta Motilidade não progressiva Sem movimento A avaliação da motilidade dever ser feita imediatamente após a liquefação, 2h e 6 h após a primeira avaliação

Células Epiteliais não de linhagem seminal Células redondas: Espermatogênese e células inflamatórias

Movimento Progressivo Direcional Percentual de frequência 100% e 90%: Não existe 80%: Pouco frequente 70%: Frequente 60%: Muito frequente 50%: Muito frequente 40%: Pouco frequente 30%: Pouco frequente 20%: Raro 10%: Raro

Movimento Progressivo Pouco Direcional (lento) Percentual de frequência 60%: Raro 50%: Frequente 40%: Muito frequente 30%: Muito frequente 20%: Frequente 10%: Raro

Movimento Progressivo Não Direcional (lento) Percentual de frequência 40%: Pouco frequente 30%: Frequente 20%: Muito frequente 10%: Muito frequente

Vitalidade Reflete a proporção de espermatozoides que estão "vivos“ na amostra, o método de escolha é a técnica de coloração Eosina / Nigrosina Baseia-se na “integridade funcional da membrana plasmática viva”, que não permite a passagem do corante, enquanto a membrana das células mortas permite a passagem do corante Espermatozoides vivos – não corados Espermatozoides mortos – corados

Reagentes Eosina amarela ou amarelada (Merck) – solução salina a 3%, estocar em temperatura ambiente Nigrosina hidrossolúvel (Merck) – solução a 8% em salina Pesar 8 gramas de nigrosina, tornando-a pó fino em um gral Adicionar 10 ml de etanol a 95o Levar a estufa de 100 oC até evaporação do etanol Adicionar salina lentamente, mexendo a nigrosina até completa dissolução, completa volume em 100 ml, estocar a temperatura ambiente e filtrar periodicamente

Técnica Colocar uma gota de sêmen bem homogeneizado sobre uma lâmina de microscopia Adicionar 2 gotas de solução de Eosina a 3% e misturar imediatamente Adicionar rapidamente 3 a 4 gotas de suspensão de Nigrosina a 8% e misturar imediatamente Preparar 4 esfregaços bem grossos com a mistura acima, secando-os rapidamente (secador de cabelo) Observar ao microscópio, com objetiva de imersão, contar 100 gametas (vivos e mortos)

Valores de referência Acima de 70% de vivos Necrospermia – acima de 30% de mortos

Contagem de espermatozoides É realizada, após a liquefação total do sêmen, em câmara de contagem. Apesar das câmaras de Horwell e de Makler serem específicas para a contagem de espermatozoides, a câmara de Neubauer (hemocitômetro) ainda é largamente utilizada.

Câmara de Neubauer É uma lâmina de vidro espessa, com uma depressão central de contagem, adaptada ao microscópio de campo claro e ao de contraste de fases É formada por 9 quadrados de 1 mm2 de área  total de 9 mm2 A depressão central é de 0.1 mm até a superfície A área marcada (L) corresponde a 1 mm2 O volume compreendido entre a superfície e a lamínula é de 0.1 mm3, ou 0.1 µL  total de 0,9 mm3

1 mm 1/25 mm3 1/400 mm3 1/16 mm3 Área de 1 mm2

𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑚 3 = 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑚 2 x 𝑝𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝑐â𝑚𝑎𝑟𝑎 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 Á𝑟𝑒𝑎 𝑒𝑚 𝑚𝑚 2

Técnica Diluir o esperma de 1/40, depois de liquefeito e homogeinizado, em solução salina a 0,9% com 5% de formaldeido Exemplo: 0,1ml de esperma + 3,9ml de solução diluente Após homogeinizar bem, colocar na câmara e aguardar 5 minutos em ambiente úmido, para sedimentação dos gametas Contar com objetiva de 40X os 5 quadrantes e multiplicar por 80.000 Com concentração alta, contar o quadrante central e multiplicar por 400.000

Outros elementos Leucócitos, hemácias, células fagocitárias, células germinativas imaturas, células de Sertoli, células epiteliais não germinativas e resíduos celulares anucleados não diferenciados Análise de pouco valor clínico, porém o  de alguns deles (leucócitos) ajuda no diagnóstico Bactérias no sêmen é um achado comum pode estar relacionada com infecções do trato genito-urinário Obs: A contagem de leucócitos e hemácias devem ser realizados na Câmara de Neubauer, considerados valores normais até 1.000 mm3

Técnicas analíticas complementares (opcionais) Detecção de anticorpos anti-espermatozóides Imunobeads, teste de aglutinação macroscópica (MAR Teste) e outros A presença destes anticorpos sugere infertilidade Marcadores bioquímicos: fosfatase ácida e ácido cítrico (marcadores da próstata) frutose e prostaglandinas (vesículas seminais) Cultura seminal

Interferentes: Medicamentos O relato do uso de medicamentos é importante na execução do exame Podem provocar aumento, ou diminuição das contagens e da motilidade dos espermatozóides ácido valpróico, cetoconazol, cimetidina, fluconazol, ramitidina, anfepramona, decanoato de testosterona, fenitoína, haloperidol, sulfassalazina, reserpina, trimetopina, cafeína e outros.

Drogas de abuso como, por exemplo: álcool, tabaco,maconha, cocaína e outras Preservativos de látex Temperaturas extremas de conservação da amostra (ideal entre 20 e 40ºC)