PCR em Tempo Real Karine Begnini

Real-Time PCR Amplificação de genes/sequências de interesse Multiplicar ácidos nucléicos e quantificar o resultado obtido PCR + fluorescência  Monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção de amplificado em cada ciclo de PCR

PCR X qRT-PCR * Similaridades: – emprego de primers, DNAs molde, polimerase nucleotídeos – reação de amplificação semelhante ao PCR * Diferenças: – equipamento – necessidade de corantes ou sondas – procedimentos de otimização diferentes – metodologia de análise do resultado

Qual o problema com os géis de agarose? * Baixa precisão * Baixa sensibilidade * Baixa resolução * Não-automatizado * Discriminação apenas pelo tamanho * Resultados não numéricos * Não é confiável quantitativamente

Qual o problema com os géis de agarose?

PCR X qRT-PCR Reação para e não são mais produzidos amplicons Reagentes começam a ser consumidos e a taxa de duplicação diminui 100% de eficiência, com exata duplicação dos amplicons em casa ciclo

PCR X qRT-PCR Área de detecção do PCR convencional Área de detecção do real time

Aplicações Gene expression- primary validation 4% 11% 13% 10% 14% 5% 9% 17% 24% 0% 15% 20% 25% 30% SNP genotyping Other Allelic discrimination Gene duplication or other DNA quantification Bacterial detection/ identification Viral load detection Gene expression-confirmation of microarray data Gene expression- primary validation DNA, cDNA and RNA as a template Only DNA as a template

Vantagens do qRT-PCR *A amplificação pode ser monitorada em tempo real * Menor risco de contaminação ambiental por amplicons * Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas) * Requer 1000x menos RNA que os ensaios convencionais *Confirmação da amplificação específica em tempo real * Mais específico, sensível e reprodutivo * Custo semelhante ao PCR convencional (excetuando-se o custo do equipamento)

Experimentação 1. Obtenção da amostra (DNA/RNA) 2. Reagentes 3. Método de detecção (sonda ou fluoróforo) 4. Controle interno (endógeno) 5. Tipos de quantificação 6. Análise dos resultados

1. Obtenção da amostra (DNA/RNA) Escolha do tipo de amostra 4% 11% 13% 10% 14% 5% 9% 17% 24% 0% 15% 20% 25% 30% SNP genotyping Other Allelic discrimination Gene duplication or other DNA quantification Bacterial detection/ identification Viral load detection Gene expression-confirmation of microarray data Gene expression- primary validation DNA, cDNA and RNA as a template Only DNA as a template

Obtenção da amostra (DNA/RNA) RNA – cDNA • Métodos de extração: * Trizol ou outros métodos similares * Livre de proteína, de DNA e de inibidores

Obtenção da amostra (RNA) CUIDADOS: Possibilidade de presença de DNA genômico ou proteínas contaminando as preparações de RNA- falso positivo RNA é um material bastante sensível e exige cuidados especiais de manipulação e armazenamento. DNA A260/280 é ~1.8 RNA A260/280 é ~2

ESTRUTURA DE UM GENE DE EUCARIOTO Promotor Região Codificadora Intron hnRNA Exon mRNA AAAAAAAAAA

Síntese de cDNA

2. Reagentes da reação

Controles Controle negativo (sem DNA) Checar os reagentes para contaminação Controle com RNA (sem transcriptase reversa) Detecta se o sinal e de contaminação com DNA Controles positivos - Checar os reagentes e primers Importante para demostrar a ausência de expressão de um gene

3. Detecção da Fluorescência 1- Agentes ligantes - intercalantes de DNA Não-específico (SYBR-Green) 2- Sonda-Primers Marcados Altamente específicos (TaqMan)

SYBR-Green * Emite grande fluorescência após ligar-se a DNA dupla fita * Não-específica * Requer otimização extensiva * Amplicons grandes emitem maior fluorescência * Não permite multiplex * Funciona baseado no aumento da fluorescência indicando aumento de material genético específico amplificado * Método mais barato

Curva de dissociação (SYBR-green) *aferição da fluorescência a 60°C - 95°C *diferentes amplicons se dissociam em diferentes temperaturas

TaqMan® * Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease da polimerase * Utiliza sondas que contém fluoróforos * Extremamente específico Permite Multiplex * Sonda: Example:FAM(reporter) and BHQ-1(quencher) Reporter(5’) e Quencher(3’) na mesma molécula: Transferência de energia, diminuindo a fluorescência do reporter

Sonda * 15-30 oligonucleotideos * Localiza-se de 1 a 5 pb do primer * Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers * A primeira base não pode ser G- 5’ Não deve ter 4 bases consecutivas iguais Baseada na atividade 5’-3’ da DNA polimerase

4. Tipos de Quantificação do Resultado Quantificação Absoluta: - Determinação do número exato de moléculas. - Correlacionar o número de cópias virais vs. estado de uma doença – DNA/RNA Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA ou RNA. Curva padrão!

4. Tipos de Quantificação do Resultado Quantificação Relativa: - Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou normalizador. São comparados os Ct’s de cada amostra e os resultados representam ordens de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).

Controle Interno (endógeno) *Usar um gene abundante e constantemente expresso *usado para normalização dos resultados *escolha baseada em: –gene com expressão relacionada com a do material que esta sendo avaliado –gene não submetido a padrões de controle muito estringentes –pode existir mais de um tipo de controle endógeno GAPDH e β-actina

5. Análise dos resultados * O Alvo é amplificado na presença do repórter * O instrumento excita e detecta o repórter * A intensidade do sinal é diretamente proporcional a quantidade de DNA amplificado * Threshold Cycle (Ct); é o ciclo aonde um aumento significativo na quantidade de amplificado é primeiramente detectado É o parâmetro usado para quantificação CT valor de 40 ou mais significa nenhuma amplificação

resultados

DDCt METHOD Normalizador D Ct = Ct target – Ct endo Amostra D Ct = Ct target - Ct endo DDCt = NormalizadorDCt- amostraDCt DDCt = diferença de expressão em relação ao normalizador

control D Ct = target - endo RPLP0 end D Ct = 9.70 IL1-b con end=19.93 av =29.63 D Ct = target - endo experiment IL1-b vit D Ct = -1.7 The difference between the two delta Ct values (delta delta Ct, represents the corrected shift of the IL1-b. Since in this example in the vitreous treated sample the IL1-b has moved to the left of the standard, it has a negative value, but in maths subtraction of a negative value is equivalent to adding that value - which makes obvious sense (I hope) if you look at the diagram - the total shift is = the two green arrows added together. If the vit il1-b had shifted but remained to the right of the reference curve, the value would then be subtracted from the large green arrow to determine the shift. RPLP0 vit Difference = DCt-DCt = DDCt = 9.70-(-1.7) = 11.40 av =18.03 end =19.80