PCR em Tempo Real RT- PCR em Tempo Real PCR quantitativo

PCR em Tempo Real Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão de um fluorescente

Quantificação em gel x Real-Time PCR: PCR em Tempo Real Quantificação em gel x Real-Time PCR: “Relação quantitativa entre quantidade de DNA inicial e a quantidade de produto durante a fase exponencial de um programa de ciclagem”

Detector de sequências a laser, totalmente automatizado

Requerimentos específicos da técnica PCR em Tempo Real Requerimentos específicos da técnica Equipamento de leitura da amplificação; Química específica de fluorescência na reação; Método matemático de correlação; Uso de soluções-padrão ou genes de referência.

PCR em Tempo Real Experimentação reação em branco, (H2O); diluição serial (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5); amostras primers: gene de interesse x gene de referência em triplicatas !!!

PCR em Tempo Real Baseline Ct - linha basal: não houve clivagem suficente do corante-repórter para que se possa detectar a fluorescência fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo fase platô: não há mais aumento no número de amplicons

Piso de Fluorescência: threshold cycle Ct Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

Ct No ponto referido como Ct a fluorescência aumenta acima da linha basal, de forma exponencial. Amostras mais concentradas (com maior no de templates iniciais) mostram valores menores de Ct. Esse fenômeno criou um novo paradigma para quantificação por PCR: é avaliado o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.

Curva de diluição Uso como referência absoluta (se for o caso); Cálculo de eficiência da reação de PCR;

Curva de diluição Ct ng/ul log TMEM_10-6 21,086 63000 4,799341 20,6472 20,7712 TMEM_10-7 24,8432 6300 3,799341 25,1673 24,8378 TMEM_10-8 28,4401 630 2,799341 28,5971 28,0928 TMEM_10-9 32,2972 63 1,799341 31,326

Genes de referência (housekeeping)

Curva de desnaturação (melt curve)

Químicas de Fluorescência em Tempo Real especificidade requerida escala de aplicação custo experiência do laboratório leitura do aparelho

Químicas de Fluorescência em Tempo Real Sybr-Green

Químicas de Fluorescência em Tempo Real TaqMan Sonda FRET: Fluorescent Resonance Energy Transfer Quencher (repressor) Atividade 5’ exonuclease da DNA polimerase

O sistema de quantificação em tempo real tem tido as seguintes aplicações: 1 - Análise da expressão gênica - RNA total (RT-PCR) 2 - Identificação de alelos em DNA genômico 3 - Análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes 4 - Análise de patógenos em alimentos 5 - Análise de produtos transgênicos, etc.... O sistema permite a detecção simultânea de até 3 fluorocromos diferentes, de modo que o controle interno ou externo pode ser analisado simultaneamente à analise da molécula alvo.

RotorGene 3000 (Corbett)

Real Time PCR Mede o aumento do sinal de fluorescencia proporcional a qtidadeDNA produzido durante cada ciclo da PCR Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

Sequenciamento de DNA Sanger, 1977 Gel radioativo Dideoxinucleotídeos A C G T Sanger, 1977