Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza Depto de Genética – UFPR lehtonen@ufpr.br www.ufpr.br/~lehtonen

PCR Reação em Cadeia da Polimerase Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas

PCR Reação de PCR: DNA dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.

Hibridação A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

PCR animação

PCR – desenho dos iniciadores Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Software para desenhar iniciadores: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

PCR – desenho dos iniciadores

PCR-RFLP Enzima de restrição: mutação cria sítio de restrição mutação elimina sítio de restrição Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese

PCR-RFLP

PCR-RFLP ALA 539 540 541 545 546 Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC.....CGT CC Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG..............3'  Fnu4HI ou BsoFI  ____________85 pb__________'________21 pb_________

PCR-RFLP 85pb 106pb UU UK KK

PCR-RFLP Vantagem: rapidez Desvantagem: algumas enzimas tem digestão parcial

PCR-SSCA (ou SSCP) Análise de Conformação de Fita Simples Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).

PCR-SSCA Padronização da técnica  vários fatores Relação bisacrilamida x acrilamida Concentração de acrilamida Tampão do gel  pH Tempo de corrida Temperatura de polimerização Temperatura da corrida

PCR-SSCA

PCR-SSCA

Seqüenciamento didesoxi Método de Sanger Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila. Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese

Seqüenciamento animação

PCR em tempo real É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.

PCR em tempo real

PCR em tempo real SYBR Green é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador. Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação

PCR em tempo real SYBR Green

PCR em tempo real Taqman

PCR em tempo real

PCR em tempo real Aplicações Quantificação Detecção de carga viral Determinação do número de cópias de um gene Análise da expressão gênica

PCR em tempo real Exemplo de aplicação: Investigação de amplificação ou deleção dos genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.

PCR em tempo real Quantificação relativa TumorCHE / Tumor18S SangueCHE / Sangue18S

PCR em tempo real Gene BCHE

Genotipagem com Taqman

Homozigoto para o alelo marcado com FAM

Heterozigoto

Homozigoto para o alelo marcado com VIC

Genotipagem

FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381 Fonte: Alves, 2009

FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495 Fonte: Alves, 2009