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Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo.

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Apresentação em tema: "Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo."— Transcrição da apresentação:

1 Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo

2 Sistema Nociceptivo Injury Peripheral Nerve Dorsal Root Ganglion Dorsal Horn Lateral Thalamus Somatosensory Cortex percepção do estímulo condução do estímulo processamento da resposta

3 DRG11: papel na nocicepção Identificação do local de expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001] Importância da proteína DRG11 no desenvolvimento do sistema nociceptivo Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo

4 DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas homeodomain 1263 Homeodomain DNA binding OAR Interacção Proteína-proteína Anti-drg11 OAR Anti-drg11 Glutationa S-transferase GST Proteína Recombinante (46kDa) 103

5 Obtenção dos anticorpos anti DRG11 Proteína de fusão GST-DRG11 (C- terminal) Soro

6 Purificação e caracterização do anticorpo: Soro Purificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade Doseamento de IgG anti- DRG11 Imunoblotting Imunofluorescência

7 Cromatografia de Afinidade Lavagens da resina de sefarose + GST-DRG11 Incubação da resina com soro overnight Separação do sobrenadante Montagem da Coluna

8 Cromatografia de Afinidade Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3 Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica Neutralização com Tris a pH 8,5

9 Doseamento Proteico: Método de Bradford Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas, numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]

10 Doseamento Proteico: Determinação da recta padrão: –Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de bovine serum albumin(BSA) e reagente de Bradford –Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm –Traçou-se a curva de calibração Gráfico 1

11 Doseamento Proteico: Preparar 10 eppendorfs com: –cada amostra do anticorpo purificado –água –reagente de Bradford Medir as absorvâncias Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão Gráfico 2

12 Western Blotting: Montagem da cassete (sistema vertical) Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços Electroforese Montagem da cassete de blotting Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose Revelação com Ponceau S Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção) kDa

13 Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção ) Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP) Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)

14 Conclusão: Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP. Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso. Gráfico 2 Imunoblotting

15 Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação. O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco. Imunofluorescência

16 Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e knockout. Procedimento: – bloqueio com soro de cabra; – incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3; –incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit) conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594); –observação dos locais de expressão da proteína usando microscopia confocal;

17 Imunofluorescência A proteína apresentou como locais de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos. +/+-/-

18 Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação. NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.

19 Bibliografia: Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: Chen et al (2001).Neuron.31: tmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein.h tml /main.htmlhttp://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confocal /main.html www4.amerishambioscience.com

20 Agradecimentos: Prof Doutor Carlos Reguenga Serviço de Histologia e Embriologia de Abel Salazar Drª. Sandra Rebelo


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