Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11

Apresentação em tema: "Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11"— Transcrição da apresentação:

1 Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11
Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo

2 processamento da resposta
Sistema Nociceptivo percepção do estímulo Somatosensory Cortex Injury Lateral Thalamus condução do estímulo Peripheral Nerve Dorsal Root Ganglion Dorsal Horn processamento da resposta

3 DRG11: papel na nocicepção
Identificação do local de expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001] Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo Importância da proteína DRG11 no desenvolvimento do sistema nociceptivo

4 Glutationa S-transferase
DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas homeodomain Anti-drg11 103 1 263 Homeodomain DNA binding OAR Interacção Proteína-proteína Proteína Recombinante (46kDa) Anti-drg11 GST OAR Glutationa S-transferase Interacção Proteína-proteína

5 Obtenção dos anticorpos anti DRG11
Proteína de fusão GST-DRG11 (C-terminal) Soro

6 Purificação e caracterização do anticorpo:
Soro Purificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade Imunoblotting Doseamento de IgG anti-DRG11 Imunofluorescência

7 Cromatografia de Afinidade
Lavagens da resina de sefarose + GST-DRG11 Incubação da resina com soro “overnight” Separação do sobrenadante Montagem da Coluna

8 Cromatografia de Afinidade
Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3 Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica Neutralização com Tris a pH 8,5

9 Doseamento Proteico: Método de Bradford
Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas , numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]

10 Doseamento Proteico: Determinação da recta padrão:
Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de “bovine serum albumin”(BSA) e reagente de Bradford Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm Traçou-se a curva de calibração Gráfico 1

11 Doseamento Proteico: Preparar 10 eppendorfs com: Medir as absorvâncias
cada amostra do anticorpo purificado água reagente de Bradford Medir as absorvâncias Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão Gráfico 2

12 Western Blotting: Montagem da cassete (sistema vertical)
Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços Electroforese Montagem da cassete de blotting Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose Revelação com Ponceau S Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção) kDa 97 56 45 36

13 Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó
Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção ) Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP) Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)

14 Imunoblotting Conclusão:
Conclusão: Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP. Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso. Gráfico 2

15 Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação. O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco. Imunofluorescência

16 Imunofluorescência Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e “knockout”. Procedimento: bloqueio com soro de cabra; incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3; incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit) conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594); observação dos locais de expressão da proteína usando microscopia confocal;

17 Imunofluorescência A proteína apresentou como locais de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos. +/+ -/-

18 Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação.
NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.

19 Bibliografia: Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: Chen et al (2001).Neuron.31:59-53 www4.amerishambioscience.com

20 Agradecimentos: Prof Doutor Carlos Reguenga Serviço de Histologia e Embriologia de Abel Salazar Drª. Sandra Rebelo