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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica.

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1 Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

2 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

3 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente)

4 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente)

5 Espectofotometria

6 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente) A (contaminantes)

7 max =260 nm max =260 nm max(proteínas) =280 nm max(proteínas) =280 nm ref =320 nm ref =320 nm Concentração = f(OD 260 ). Se L=1cm: Concentração = f(OD 260 ). Se L=1cm: dsDNA 1OD=50µg/ml dsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) (se puro deve situar-se entre 1.75 e 2) (se puro deve situar-se entre 1.75 e 2) Quantificação de DNA

8 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

9 Fazer um gel de agarose

10 Electroforese

11

12 ELECTROFORESE V=IR V=IR P=I 2 R P=I 2 R A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução

13 TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE) Agarose (TAE e TBE) Seakam Seakam Nusieve Nusieve Nusieve 3:1 Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc) outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturante formamida como desnaturante Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturante SDS como desnaturante Horizontais Verticais

14 Limitações da Electroforese Eficaz de 100bp até no máximo 50kb Eficaz de 100bp até no máximo 50kb Deixa de fora muitos fragmentos Deixa de fora muitos fragmentos Deixa de fora os cromossomas Deixa de fora os cromossomas Não permite separar simultâneamente os fragmentos pequenos e grandes Não permite separar simultâneamente os fragmentos pequenos e grandes Ineficaz para caracterizar genotipos complexos de organismos Ineficaz para caracterizar genotipos complexos de organismos

15 Electroforese Convencional Matriz semisólida Matriz semisólida Campo eléctrico Campo eléctrico uniforme uniforme Estático Estático Moleculas migram Moleculas migram Segundo uma única dimensão Segundo uma única dimensão Uniformemente ao longo da electroforese Uniformemente ao longo da electroforese

16 Solução: PFGE Campo eléctrico variável Campo eléctrico variável Direcção variavel Direcção variavel Duração variável Duração variável Intensidade variável Intensidade variável As moléculas respondem ao campo elétrico: As moléculas respondem ao campo elétrico: Reorientando-se (a maior parte do tempo) Reorientando-se (a maior parte do tempo) Reorientação dependente do ângulo dos campos elétricos anternantes Reorientação dependente do ângulo dos campos elétricos anternantes Migrando no gel (no tempo que sobra) Migrando no gel (no tempo que sobra)

17 Electroforese em Campo Pulsado (PFGE) Field-inversion G.E. Field-inversion G.E. Transverse-Alternating Field G.E. Transverse-Alternating Field G.E. Rotating Gel Electrophoresis Rotating Gel Electrophoresis Contour-Clamped Homogeneous Electric Field Contour-Clamped Homogeneous Electric Field Orthogonal-FieldAlternation G.E. Orthogonal-FieldAlternation G.E. Programable Autonomously- controled Electrodes Programable Autonomously- controled Electrodes Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis

18 Field inversion gel electrophoresis (FIGE) Ângulo de 180º Ângulo de 180º Pulsos Forward/reverse Pulsos Forward/reverse Tempo F/R=3:1 Tempo F/R=3:1 Se pulsos aumentam com a corrida, melhora a resolução (swich time ramping) Se pulsos aumentam com a corrida, melhora a resolução (swich time ramping) Resolução aceitável até 800 kb Resolução aceitável até 800 kb

19 Traverse-alternating field gel electrophoresis (TAFE) Gel vertical Gel vertical Campos eléctricos fora do plano do gel Campos eléctricos fora do plano do gel DNA zigzagueia no gel DNA zigzagueia no gel Ângulo dos campos difere ao longo do gel Ângulo dos campos difere ao longo do gel Aumenta a resolução pois Aumenta a resolução pois DNA maiores menor ângulo de reorientação DNA maiores menor ângulo de reorientação DNA menores maior ângulo de reorientação DNA menores maior ângulo de reorientação Separações até 1,600 kb Separações até 1,600 kb

20 Rotating Gel Electrophoresis (RGE) Gel roda com campo desligado Gel roda com campo desligado Campo eléctrico uniforme Campo eléctrico uniforme Fácil de fazer protocolos com Fácil de fazer protocolos com Ramping voltage Ramping voltage Ramping time pulse Ramping time pulse Ângulo variável Ângulo variável Tempo para a mudança do ângulo é o mais longo Tempo para a mudança do ângulo é o mais longo Separações de 50 kb a 6000 kb Separações de 50 kb a 6000 kb

21 Contour Clamped Homogeneous Electric Fields (CHEF) Solução mais sofisticada Solução mais sofisticada Campo elétrico uniforme Campo elétrico uniforme resistores aplicados a todos os 24 eléctrodos resistores aplicados a todos os 24 eléctrodos Todas as lanes são perfeitamente paralelas Todas as lanes são perfeitamente paralelas Ângulo de reorientação de 120º Ângulo de reorientação de 120º Separações até 7,000 kb Separações até 7,000 kb

22 Aspectos Criticos em PFGE Pulse Time e rapidez de mudança Pulse Time e rapidez de mudança Suficientemente longo para haver corrida Suficientemente longo para haver corrida Suficientemente curto para haver principalmente reorganização Suficientemente curto para haver principalmente reorganização Forma do campo eléctrico Forma do campo eléctrico Número e configuração dos eléctrodos Número e configuração dos eléctrodos Ângulo dos campos Ângulo dos campos Sempre >100º Sempre >100º Óptimo entre 120º e 150º Óptimo entre 120º e 150º Nunca 90º Nunca 90º Ângulos variáveis tornam as bandas mais finas Ângulos variáveis tornam as bandas mais finas Voltagem 6-10V/cm (DNA< 1 Mb) <2 V cm (3-6 Mb) 1.5 V/cm (>12 Mb) Menor V => aumento tempo Temperatura Arrefecimento e recirculação do tampão é mandatório Ar condicionado eficiente e 24h/dia – 7dias/semana 14ºC – 22ºC Escolha da enzima de restrição Deve originar: Grandes fragmentos Poucos fragmentos

23 Utilização do PFGE Genotipagem bacteriana Genotipagem bacteriana Discriminação de surtos de infecção nosocomial Discriminação de surtos de infecção nosocomial Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes bacterianas patogénicas Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes bacterianas patogénicas Mapas genéticos de mais de 180 bactérias Mapas genéticos de mais de 180 bactérias Mapa do genoma humano Mapa do genoma humano Isolamento e caraterização de cromossomas Isolamento e caraterização de cromossomas Construção de bibliotecas Construção de bibliotecas Construção de YAC Construção de YAC Produção de Ratinhos transgénicos Produção de Ratinhos transgénicos

24 Exemplo de PFGE

25 Electroforese Capilar Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Separações muito boas, num período de tempo inferior. Separações muito boas, num período de tempo inferior.

26 Electroforese Capilar (II) Elevada voltagem Elevada voltagem Grande velocidade Grande velocidade Produção de calor Produção de calor Janela de detecção Janela de detecção Capilar fino Capilar fino Eficiente gestão do calor Eficiente gestão do calor Matriz de separação Matriz de separação Tampão condutor Tampão condutor

27 Electroforese Capilar (III) Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo todas as moléculas migram para o pólo negativo velocidade depende da carga e do peso molecular velocidade depende da carga e do peso molecular Fluxo Electroendosmótico (FEO) Fluxo Electroendosmótico (FEO) Superfície do capilar C/ grupos negativos Superfície do capilar C/ grupos negativos Junto à superficie grupos positivos: Junto à superficie grupos positivos: migram para o polo negativo arrastam consigo o tampão/solvente arrastam consigo o tampão/solvente

28 Electroforese Capilar (IV) Detecção por fluorescência Detecção por fluorescência Moléculas marcadas Moléculas marcadas Fluorocromos c/ afinidade Fluorocromos c/ afinidade Sinal quantitativo Sinal quantitativo Grande sensibilidade Grande sensibilidade Sinal em função do tempo Sinal em função do tempo Imagem de gel simulada Imagem de gel simulada Grande resolução Grande resolução

29 Electroforese Capilar (V) DNA Demo Videos: 1-Load MatrixLoad Matrix 2-Load Samples/markers 3-RunRun

30 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

31 REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Brometo de etidio e análogos Brometo de etidio e análogos Radioactividade Radioactividade 32 P e 33 P 32 P e 33 P 35 S 35 S 125 I 125 I 14 C 14 C 3 H 3 H Tempos de exposição Tempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidor Cassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geis Necessidade de secagem dos geis Nitrato de prata Nitrato de prata

32 Marcação de sondas Radio-isótopos Radio-isótopos 32 P 32 P 33 P 33 P 35 S 35 S 3 H 3 H 14 C 14 C 125 I 125 I

33 Digoxigenina Digoxigenina Biotina Biotina detecção directa da cadeia dupla detecção directa da cadeia dupla Marcação de sondas

34 Enzimas para a marcação de sondas Polimerases Polimerases Actividade exonucleolitica Actividade exonucleolitica Temp. optima Temp. optima estabilidade térmica estabilidade térmica TdT TdT

35 Tipos de sondas Oligonucleótidos Oligonucleótidos inserts de plasmideos inserts de plasmideos prod. de PCR prod. de PCR

36 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

37 Fotografia

38 FOTOGRAFIA Abertura do diafragma Abertura do diafragma Tempo de exposição Tempo de exposição Focagem e profundidade de foco Focagem e profundidade de foco Filtros necessários Filtros necessários Tipos de fotos Polaroid Tipos de fotos Polaroid Sistemas alternativos Sistemas alternativos

39 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

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41 Aquisição computorizada de imagens de geis

42 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

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44 Integração de histogramas

45 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

46 Reacção de restrição

47 SISTEMAS R-M Protecção contra DNA estranho Protecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas) TIPO II: (93% das enzimas) reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias As endonucleases requerem Mg 2+ e as metiltransferases requerem s- adenosylmetionina As endonucleases requerem Mg 2+ e as metiltransferases requerem s- adenosylmetionina endonucleases compostas por um homodimero endonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomero metiltransferases compostas por monomero

48 SISTEMAS R-M TIPO IIs: TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantes TIPO IV: as restantes

49 MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO Instabilidade térmica Instabilidade térmica Concentração de glicerol Concentração de glicerol Tampão de reacção Tampão de reacção Actividade enzimática: Actividade enzimática: 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNA conformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzima utilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µl volume total > 50µl Homogeneizar por pipetagem Homogeneizar por pipetagem Verificar a temperatur de reacção Verificar a temperatur de reacção


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