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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica.

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Apresentação em tema: "Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica."— Transcrição da apresentação:

1 Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

2 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

3 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente)

4 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente)

5 Espectofotometria

6 Espectrofotometria Lei de Bert-Lambert Lei de Bert-Lambert C= A C= A max L=1 cm A (suporte) A(solvente) A (contaminantes)

7 max =260 nm max =260 nm max(proteínas) =280 nm max(proteínas) =280 nm ref =320 nm ref =320 nm Concentração = f(OD 260 ). Se L=1cm: Concentração = f(OD 260 ). Se L=1cm: dsDNA 1OD=50µg/ml dsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência). Quantificação de DNA

8 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

9 Fazer um gel de agarose

10 Electroforese

11

12 ELECTROFORESE V=IR V=IR P=I 2 R P=I 2 R A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução

13 TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE) Agarose (TAE e TBE) Seakam Seakam Nusieve Nusieve Nusieve 3:1 Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc) outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturante formamida como desnaturante Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturante SDS como desnaturante Horizontais Verticais

14 Electroforese em campo pulsado (PFGE)

15 Electroforese Capilar Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Separações muito boas, num período de tempo inferior. Separações muito boas, num período de tempo inferior.

16 Electroforese Capilar (II) Fluxo Electro-osmótico (FEO): Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC. todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.

17 Electroforese capilar (III)

18 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

19 REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Brometo de etidio e análogos Brometo de etidio e análogos Radioactividade Radioactividade 32 P e 33 P 32 P e 33 P 35 S 35 S 125 I 125 I 14 C 14 C 3 H 3 H Tempos de exposição Tempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidor Cassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geis Necessidade de secagem dos geis Nitrato de prata Nitrato de prata

20 Marcação de sondas Radio-isótopos Radio-isótopos 32 P 32 P 33 P 33 P 35 S 35 S 3 H 3 H 14 C 14 C 125 I 125 I

21 Digoxigenina Digoxigenina Biotina Biotina detecção directa da cadeia dupla detecção directa da cadeia dupla Marcação de sondas

22 Enzimas para a marcação de sondas Polimerases Polimerases Actividade exonucleolitica Actividade exonucleolitica Temp. optima Temp. optima estabilidade térmica estabilidade térmica TdT TdT

23 Tipos de sondas Oligonucleótidos Oligonucleótidos inserts de plasmideos inserts de plasmideos prod. de PCR prod. de PCR

24 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

25 Fotografia

26 FOTOGRAFIA Abertura do diafragma Abertura do diafragma Tempo de exposição Tempo de exposição Focagem e profundidade de foco Focagem e profundidade de foco Filtros necessários Filtros necessários Tipos de fotos Polaroid Tipos de fotos Polaroid Sistemas alternativos Sistemas alternativos

27 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

28

29 Aquisição computorizada de imagens de geis

30 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

31

32 Integração de histogramas

33 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Espectrofotometria Electroforese Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Reacções de restrição Sistemas R/M Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição Montar uma reacção de restrição

34 Reacção de restrição

35 SISTEMAS R-M Protecção contra DNA estranho Protecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas) TIPO II: (93% das enzimas) reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias As endonucleases requerem Mg 2+ e as metiltransferases requerem s- adenosylmetionina As endonucleases requerem Mg 2+ e as metiltransferases requerem s- adenosylmetionina endonucleases compostas por um homodimero endonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomero metiltransferases compostas por monomero

36 SISTEMAS R-M TIPO IIs: TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantes TIPO IV: as restantes

37 MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO Instabilidade térmica Instabilidade térmica Concentração de glicerol Concentração de glicerol Tampão de reacção Tampão de reacção Actividade enzimática: Actividade enzimática: 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNA conformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzima utilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µl volume total > 50µl Homogeneizar por pipetagem Homogeneizar por pipetagem Verificar a temperatur de reacção Verificar a temperatur de reacção

38 Prof.Doutor José Cabeda Genética Molecular em Medicina Transfusional Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

39 Métodos Baseados No Tm Métodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clamps Melting Profiles and GC clamps DGGE DGGE PerpendicularPerpendicular ParaleloParalelo CDGE CDGE TTGE TTGE Métodos Baseados na conformação Métodos Baseados na conformação SSCP SSCP HA HA CSGE CSGE

40 Melting Profiles Vários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

41 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico

42 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) heteroduplexes homoduplexes

43 Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

44 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão

45 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm

46 Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNA Conformação do dsDNA não depende da sequência não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência) depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

47 Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturado dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido dsDNA é diluido Renaturação rápida Renaturação rápida Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 WT2 mutantes

48 Heteroduplex Analysis (HA) Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformação Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

49 Heteroduplex Analysis (HA) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

50 Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio: Principio: Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como crosslinker, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Pode utilizar-se BAP ou PDA como crosslinker, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com bp Utilizar fragmentos com bp

51 Hibridização desnaturar

52 Hibridização Adicionar sonda

53 Hibridização

54 Adicionar substracto

55 Dot-Blot

56 Variações Hibridização em microplaca Hibridização em microplaca hibridização reversa hibridização reversa

57 DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)

58 Inno-Lippa Hibridização em filtro Hibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Hibridização reversa Marcação no produto do PCR Marcação no produto do PCR

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60 Resultados do INNO-LIPA

61 MEIA

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63 Southern Blot

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65 Northern Blot Semelhante ao Southern Semelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNA Utiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restrição Não utiliza reacções de restrição


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