Técnicas de Imunologia Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia

Técnicas de Imunologia Colheitas Utilizar o tubo correto Utilizar o tubo corretotubo corretotubo correto  Sangue /plasma  Anticoagulante apropriado EDTAEDTA CitratoCitrato heparinaheparina  Soro  Com activador da coagulação  Com activador da coagulação e gel separador do coágulo e soro

Técnicas de Imunologia Soro Coagulação deve ser completa Coagulação deve ser completa  Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem anticoagulante  Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da coagulação  Coletar minimo de 5 ml de sangue  Centrifugar os tubos a 3000/4000 RPM 5 minutos

Técnicas de Imunologia Outros tipos de Amostra (I) Urina (muito raro) Urina (muito raro) CSF CSF Saliva Saliva Liquidos de: Liquidos de:  Sinovial,  pleura,  pericárdio,  peritoneu,  BAL Utilizar Tubo c/ EDTA ou sem anticoagulante

Técnicas de Imunologia Outros tipos de Amostra (II) Biópsias (aspirados por agulha fina) Biópsias (aspirados por agulha fina)  Nódulos linfáticos  Medula óssea  Tumores  etc Utilizar Tubo c/ EDTA ou Com heparina

Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Amostras que necessitam de processamento especial Complemento Complemento  Congelar a –20ºC até 2 horas após colheita  Mantido a 37ºC até ser testado

Técnicas de Imunologia O que deve acompanhar a amostra Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco) Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco) Sexo, data de nascimento Sexo, data de nascimento Exame requisitado Exame requisitado Patologia suspeita Patologia suspeita Tipo de amostra Tipo de amostra Data e hora da colheita Data e hora da colheita Nome,código e assinatura do Médico requisitante Nome,código e assinatura do Médico requisitante

Técnicas de Imunologia Razões de rejeição de amostras Colheita inapropriada Colheita inapropriada  Tubo errado  Condições de manutenção/transporte incorretas  Informação incorrecta/ilegível no tubo  Informação no tubo discordante da requisição  Hemólise  Volume insuficiente  Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)

Técnicas de Imunologia Técnicas baseadas em Imunoglobulinas Ligação dos anticorpos é específica Ligação dos anticorpos é específica Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de ligandos Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de ligandos Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduo Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduo

Técnicas de Imunologia Anticorpos como reagentes Preparação de Anticorpos policlonais Preparação de Anticorpos policlonais  Inoculação/estimulação de animais  Adjuvantes  Que animal  Que via de inoculação/estimulação  Colheita, preparação e teste do soro  Estimulação repetida leva a uma maturação da especificidade do Ab

Técnicas de Imunologia Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia

Técnicas de Imunologia Técnicas baseadas em imunoglobulinas Ensaios Liquídos (ensaios homogéneos) Difração da luz Difração da luz  Nefelometria  turbidimetria Outros ensaios liquidos Outros ensaios liquidos  EMIT  CEDIA Imunofluorescência Imunofluorescência Aglutinação Aglutinação Quimioluminescência Quimioluminescência Ensaios Sólidos Ensaios Sólidos (ensaios heterogéneos) ELISA ELISA  Competitivo  Não-competitivo indirecto RIA RIA

Técnicas de Imunologia Técnicas baseadas na difracção da luz Nefelometria Baseada na reacção de imunoprecipitação Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes  31º permite melhor razão sinal/ruído Imunoturbidimetria Baseada na reacção de imunoprecipitação Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada

Técnicas de Imunologia Curva de imunoprecipitação Assumindo: Assumindo:  Ig pelo menos bivalentes IgG  Antigénio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso

Técnicas de Imunologia Cinética da Curva de imunoprecipitação A reação inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reação inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reação prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reação A reação prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reação

Técnicas de Imunologia Imunofluorescência Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de detecção Grande aumento na rapidez de detecção Vantagens relativamente à RIA: Vantagens relativamente à RIA:  Tão sensivel  Reagentes mais estáveis  Mais fácil de implementar

Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (II) Fluorescent Quenching assay Fluorescent Quenching assay  Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa  Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar)  A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo  A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo  Método indirecto

Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (III) Substrate labelled Fluorescent immunoassay Substrate labelled Fluorescent immunoassay  Método indirecto  Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado  Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab

Técnicas de Imunologia Técnicas de imunofluorescência (IV) Fluorescent energy transfer immunoassay Fluorescent energy transfer immunoassay  Método competitivo  Analito conjugado com FITC  Anticorpo ligado a Rodamina  Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina  Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina

Técnicas de Imunologia Aglutinação Baseada na reacção ag-ab Baseada na reacção ag-ab Observada visualmente Observada visualmente Tipos: Tipos:  Directa (ABO)  IgM aglutina várias RBC  IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte  Indirecta ou passiva  Antigénio ligado a subtância inerte  Reversa  Anticorpo ligado a substância inerte

Técnicas de Imunologia Aglutinação de partículas Mais sensiveis que a aglutinação Mais sensiveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar

Técnicas de Imunologia Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes

Técnicas de Imunologia Ensaios em fase sólida ELISA ELISA  Sandwich ou de captura

Técnicas de Imunologia Imunofixação Electroforese Electroforese Aplicação de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Aplicação de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas não pp são lavadas Proteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosin Corar os pp com amido black nigrosin