Aula 1 – Introdução a Química Analítica Instrumental Parte 2 Prof. Julio C. J. Silva Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas Depto. de Química Juiz de Fora, 2o Semestre, 2015 QUI 154/150 – Química Analítica V Análise Instrumental

Amostras e Métodos Analíticos

AMOSTRAGEM “O objetivo da amostragem é coletar uma porção representativa para análise, cujo resultado fornecerá uma imagem mais próxima do universo estudado” “Não importando que a amostragem seja simples ou complexa, todavia, o analista deve ter a certeza de que a amostra de laboratório é representativa do todo antes de realizar a análise” “Freqüentemente, a amostragem é a etapa mais difícil e a fonte dos maiores erros. A confiabilidade dos resultados finais da análise nunca será maior que a confiabilidade da etapa de amostragem”

AMOSTRAGEM

AMOSTRAGEM Unidades de amostragem

Número de Amostras de Laboratório Farmacopeia Exemplo: O limite máximo de Arsênio em alimentos é de 5 mg/kg. Qual massa de amostra deve ser tomada para a realização da análise? Resposta: 4 gramas

Número de Amostras de Laboratório Exemplo: Verificou-se que a estimativa de variabilidade do teor de níquel num carregamento de minério, com base em 16 determinações, era de ±1,5%. Quantas amostras devem ser tomadas para ser obtido (a 95% de confiança) um erro de amostragem menor que 0,5% de níquel? Resposta: 41 amostras

Número de Amostras de Laboratório L(%) = (100 x E)/z – L  Intervalo de confiança – E  Erro absoluto (x i – x 0 ) – Z  Valor aproximado (em %) do analito Exemplo: Estime o número adequado de análises repetidas (a) para determinar aproximadamente 2% de Cl- em uma amostra, se o desvio padrão das determinações for 0,051, (b) para 20% de Cl, com desvio de 0,093. Resposta: (a) n=3, (b) n=2

Métodos de Calibração Gráficos De Calibração Em Análise Instrumental “Calibração é um conjunto de operações que estabelece, sob condições especificadas, a relação entre valores indicados por um instrumento de medição ou sistema de medição ou valores representados por uma medida materializada ou um material de referência, e os valores correspondentes estabelecidos por padrões” ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, 2004.

Correlação e Regressão Em análise instrumental normalmente é necessário calibrar o instrumento A maneira usual para realizar calibração é submeter porções conhecidas da quantidade (p. ex. usando-se um padrão de medida ou material de referência) ao processo de medição e monitorar a resposta da medição Curva de calibração  gráfico da resposta do instrumento (eixo y) em relação a concentração dos padrões (eixo x) Curva e amostra desconhecida devem estar nas mesmas condições experimentais para que a concentração da amostra desconhecida seja determinado por interpolação gráfica da curva Condições a serem verificadas: – Verificar se o gráfico é linear ou não – Encontrar a melhor curva que se ajusta aos pontos – Quais são os erros e IC para a inclinação e intercepto da linha? – Quais erros e o IC para a concentração determinada? – Qual é o limite de detecção (LD = é a menor concentração do analito que pode ser detectado com um predeterminado nível de confiança)

Coeficiente de Correlação Coeficiente de correlação de Pearson (r)  verificar se existe uma relação linear entre duas variáveis x i e y i n = n pontos experimentais r = ± 1 (r  +1  correlação positiva) r = ± 1 (r  -1  correlação negativa) r = ± 1 (r  0  sem correlação, ou curva não linear)

Coeficiente de Correlação

Significância do valor de r: : Rejeitar H 0 = 0 se o valor absoluto de r for maior do que o valor dado na tabela Teste t para a significância da correlação, para n -2 graus de liberdade

Regressão Linear (métodos dos mínimos quadrados) Método dos mínimos quadrados: estabelecer a melhor reta que passa pelos pontos (modelo de regressão), quando o erro em x é considerado desprezível Equação da reta  y = bx + a – b = inclinação da reta (slope) – a = interseção no eixo x (coeficiente linear) – y = variável dependente (resposta) – x = variável independente (concentração) Parâmetros da reta de regressão

Regressão Linear (métodos dos mínimos quadrados)

Erros na inclinação e na interseção da reta Erro da inclinação Resíduo = y i – (bx i + a)

Erros na inclinação e na interseção da reta Desvio padrão da inclinação (b) Desvio padrão da interseção da reta (a)

Erros na estimativa da concentração Y 0 = resposta de y para a concentração desconhecida (x 0 ) m = número de replicatas n = número de pontos as curva Os erros aleatórios também podem influenciar a exatidão dos resultados obtidos a partir de curvas de calibração. Pode-se observar que o desvio padrão na concentração S x0 do analito, obtido de uma curva de calibração, é mínimo quando a resposta (previsão de y) se aproxima do valor médio (previsão média de y). O ponto x(média), y (média) representa o centro da reta de regressão. Os pontos próximos desse valor são determinados com mais certeza que aqueles mais distantes da região central.

Erros na estimativa da concentração

Regressão Linear (métodos dos mínimos quadrados)

Exemplo: Na determinação de um fármaco por fluorescência em meio ácido foram obtidos os seguintes resultados: a)Calcule o valor de r e a equação da reta b) Considerando que a intensidade de uma amostra desconhecida foi de 16,1, calcule o valor estimado de quinina na amostra. c) Calcule os desvios padrões e os intervalos de confiança a 95% da inclinação e da interseção da reta. d) Calcule o erro da concentração S x0 para a concentração de [x] e seu IC (95%) Resposta: r = 0,9987; b = 48,3; a = 0,24; [x] = 0,32 mg L -1 ; Sb = 1,427; IC(b) = 48,3  4,54; Sa = 0,3496; IC(a) = 0,24  1,11; S x0 =  0,016 e IC(x0) = 0,32  0,05 mg L -1 Concentração de quinina (mg L -1 ) 0,000,100,200,300,40 Valores de fluorescência0,005,209,9015,3019,10

MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO ERROS NO COEFICIENTE ANGULAR (Y) E NO INTERCEPTO (X)

MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO y = b.x E + a, y = 0 → x E = - a/b

Método do Padrão Interno (PI) No método do padrão interno, uma quantidade conhecida da espécie que atua como referência é adicionada a todas as amostras, padrões e brancos. Então o sinal de resposta não é aquele do próprio analito, mas sim da razão entre o sinal do analito e o da espécie de referência. É preparada, como de maneira usual, uma curva de calibração na qual o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x, a concentração do analito nos padrões. Adição de quantidade conhecida de elemento nos padrões e na amostra Corrige variações no sinal analítico devido a mudanças nas condições de análise

Método do Padrão Interno (PI)

Validação de métodos e Figuras de Mérito Validação – Faixa de trabalho – Linearidade – Sensibilidade – Limite de detecção – Limite de quantificação – Exatidão (CRM) – Teste de hipótese (teste t = 95%) – Adição e recuperação (spike) – Repetitividade (p-alto e p-baixo, n=10) – Correção de interferências (adição de padrão) – Registro de validação – Robustez – Ensaio interlaboratorial – Incerteza de medição

Validação de métodos e Figuras de Mérito Limite de detecção (LD) e Quantificação (LQ): é a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de confiança. Toda técnica analítica tem um limite de detecção. Um valor de k de 3 corresponde a um nível de confiança de 98%

Validação de métodos e Figuras de Mérito Adição e recuperação (spike): Amostra gravimetricamente contaminada

Curva analítica Curva adição de padrão Determinação da Concentração

Curva analítica Curva adição de padrão Determinação da Concentração

Limite de detecção (LD): menor quantidade que pode ser detectada com razoável certeza para um dado procedimento analítico (IUPAC) Determinação da Concentração y = y bco + 3xSd bco  em termos de sinal LD = (C bco + 3xSd bco )/S  em termos concentração LQ = (C bco + 10xSd bco )/S  em termos concentração onde: LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação (o INMETRO recomenda usar o primeiro ponto da curva analítica de calibração) y = menor sinal medido y bco = sinal do banco C bco = concentração do branco (considerado = zero) Sd bco = desvio padrão do branco (n= 10 no mínimo) S = Sensibilidade (coef. angular da curva analítica (b))

Referências -Cadore, S. Notas de aula. IQ, UNICAMP, Santos, M., Notas de aula. Depto Química, UFJF D. A. SKOOG, D. M. WEST, F. J. HOLLER e S. R. CROUCH – Fundamentos de Química Analitica, 1 a ed., Thomson, Baccan, N., Química Analítica Quantitativa Elementar. 3 a Ed. Edgard Blucher LTDA - James N. Miller & Jane C. Miller. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, fourth edition. Person Education. -ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, Lowinsohn, D., Notas de aula. Depto. de Química, UFJF