Meselson & Stahl, 1958
DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’ 3’ DNA polimerase necessita de sequência iniciadora (“primer”), com grupo 3’-OH livre
Síntese de DNA na direcção 5’ 3’ (cadeia líder) (cadeia seguidora) (garfo de replicação) Reiji Okasaki et al., 1960
A A G T C 5’ 3’ Ligação fosfodiéster Terminal 5’ Terminal 3’
dTTP
DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’ 3’ DNA polimerase necessita de sequência iniciadora (“primer”), com grupo 3’-OH livre
3’ 5’ PRIMASE 3’ 5’ 3’ 5’ RNA (primer) DNA POLIMERASE 3’ 5’ 3’ DNA
FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO Frequência de erros na introdução de nucleótidos pela DNA polimerase: Frequência de erros na replicação: (actividade de exonuclease 3’→5’ da DNA polimerase)
Polymerase Chain Reaction (PCR) Reacção em cadeia catalizada pela polimerase + DNA polimerase dATP + dCTP dGTP dTTP (Nucleótidos) + (Primers em excesso) 1º Ciclo
2º Ciclo
3º Ciclo
Desnaturação: 95ºC Emparelhamento dos primers: 50-60ºC Extensão das cadeias pela DNA polimerase: 72ºC para a Taq polimerase
Características dos primers a usar no PCR? ~20 nucleótidos de DNA em cadeia simples Emparelhamento com o terminal 3’ de cada uma das cadeias a amplificar Específicos para o fragmento a amplificar Temperatura de emparelhamento semelhante para os dois primers do par Não devem formar dímeros consigo próprios ou entre si
Cálculo da temperatura de fusão (T m ) de um primer: T m =(4 [G+C]) + (2 [A+T]) Usar na reacção de PCR temperatura de emparelhamento dos primers 4ºC inferior à T m