Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F no Diagnóstico Diferencial de Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL negativas e sua Associação com a Expressão da Proteína Antiapoptótica Survivina como Marcador Prognóstico Coordenador(a): Maria Cláudia Santos da Silva Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Ciências da Saúde Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias

LOEH Coordenador(a): Profa Dra Maria Cláudia Santos da Silva Equipe: Profa. Ms. Joanita Ângela Gonzaga Del Moral (Departamento de Clínica Médica//UFSC) Ana Carolina Rabello de Moraes – Doutoranda PGFAR/UFSC Marley Aparecida Licínio- – Mestranda PGFAR/UFSC Michelle Maccharini Barcelos – Mestranda PGFAR/UFSC. Manoela Lira Reis - Estagiária de Iniciação Científica Pâmela Cristina Gaspar - Estagiária de Iniciação Científica LOEH

Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Introdução: Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Leucemia Mieloide Crônica (LMC) Policitemia Vera (PV) Trombocitemia Essencial (TE) Mielofibrose Primária (MFP) Leucemia Neutrofílica Crônica (LNC) Leucemia Eosinofílica Crônica (LEC) Síndrome Hipereosinofílica (SHE) Doença do Mastócito (DM) Em 2008 a OMS estabeleceu nova classificação para NMP. Entre elas está o grupo das NMPc, que são as mais frequentes. Além disso novos critérios para o diagnóstico foram estabelecido. Por ex. na LMC.... LMC foi a primeira doença maligna claramente relacionada a uma anormalidade genética, e um achado característica na leucemia mielóide crônica é a presença da proteína aberrante BCR/ABL, que é produta da translocação cromossômica entre os cromossomos 9 e 22. Sendo assim, as outras 3 neoplasia são classificadas de NMPC BCR/ABL negativas. Até 2008, o diagnósticos das NMPC BCR/ABL negativas era realizado através da análise dos sintomas e de achados de mieloproliferação excessiva no hemograma e na biópsia de mo dos pacientes. Entretando, a conclusão do diagnóstico era sempre mto dificil devido à sobrepodição de sinais e sintomas com outras doenças não oncológicas. Ou seja, não existia nenhum sintomas ou achado laboratorial específico das NMPC BCR/ABL negativas. Policitemia Vera: 90% Trombocitemia Essencial: 50% Mielofibrose Primária: 50% Neoplasia Mieloproliferativa sem Classificação LOEH

NMP crônicas Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Introdução: Leucemia Mielóide Crônica (LMC) NMP crônicas Policitemia Vera (PV) Trombocitemia Essencial (TE) Em 2008 a OMS estabeleceu nova classificação para NMP. Entre elas está o grupo das NMPc, que são as mais frequentes. Além disso novos critérios para o diagnóstico foram estabelecido. Por ex. na LMC.... LMC foi a primeira doença maligna claramente relacionada a uma anormalidade genética, e um achado característica na leucemia mielóide crônica é a presença da proteína aberrante BCR/ABL, que é produta da translocação cromossômica entre os cromossomos 9 e 22. Sendo assim, as outras 3 neoplasia são classificadas de NMPC BCR/ABL negativas. Até 2008, o diagnósticos das NMPC BCR/ABL negativas era realizado através da análise dos sintomas e de achados de mieloproliferação excessiva no hemograma e na biópsia de mo dos pacientes. Entretando, a conclusão do diagnóstico era sempre mto dificil devido à sobrepodição de sinais e sintomas com outras doenças não oncológicas. Ou seja, não existia nenhum sintomas ou achado laboratorial específico das NMPC BCR/ABL negativas. Policitemia Vera: 90% Trombocitemia Essencial: 50% Mielofibrose Primária: 50% Mielofibrose Primária (MFP) LOEH Barcelos, M. M. (2011).

NMP crônicas Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Introdução: Leucemia Mielóide Crônica (LMC) NMP crônicas Policitemia Vera (PV) NMPCs BCR/ABL negativas Trombocitemia Essencial (TE) Mielofibrose Primária (MFP) Barcelos, M. M. (2011).

Hematopoiese LOEH Célula Tronco Multipotente Célula Tronco Linfoide Célula Tronco Mieloide Basófilos Reticulócito Eritroblasto Ortocromático Eritroblasto Policromático Eritroblasto Basófilo Proeritroblasto Basófilo imaturo Eosinófilo imaturo Bastonete Mielócito Promielócito Mieloblasto Promonócito Metamielócito Eosinófilos Eritrócitos Plaquetas Monócitos Neutrófilos Linfócitos T e B Megacariócito Monoblasto Hematopoiese LOEH Fonte: http://www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm

Neoplasias Mieloproliferativas Célula Tronco Multipotente Célula Tronco Linfoide Célula Tronco Mieloide Basófilos Reticulócito Eritroblasto Ortocromático Eritroblasto Policromático Eritroblasto Basófilo Proeritroblasto Basófilo imaturo Eosinófilo imaturo Bastonete Mielócito Promielócito Mieloblasto Promonócito Metamielócito Eosinófilos Eritrócitos Plaquetas Monócitos Neutrófilos Linfócitos T e B Megacariócito Monoblasto Neoplasias Mieloproliferativas LllLeucemia mielóide crônica Mielofibrose primária Leucemia mielomonocítica Trombocitemia essencial Policitemia vera LOEH Fonte: http://www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm

Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Constituem um grupo heterogêneo de doenças hematopoiéticas clonais Expansão clonal Acúmulo de células maduras em sangue periférico Elevado risco de eventos trombóticos Risco de desenvolvimento de LMA e SMD LOEH MORAES, A.C.R.

Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Difícil devido à sobreposição de sinais e sintomas com outras doenças não oncológicas Sintomas Hemograma Biópsia de medula óssea LOEH

Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Mutação pontual: substituição de uma guanina por timina JAK2V617F GOLDMAN, 2005 (N Engl J Med) Policitemia Vera: 90% Trombocitemia Essencial: 50% Mielofibrose Primária: 50% LOEH Barcelos, M. M. (2011).

Objetivo Avaliar a importância da investigação da mutação JAK2V617F no diagnóstico diferencial de neoplasias mieloproliferativas BCR/ABL negativas (Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Mielofibrose Primária) e sua associação com a expressão da proteína antiapoptótica survivina como marcador prognóstico. LOEH

Objetivos específicos Investigar a presença da translocação t(9;22) nas amostras de sangue total e/ou na medula óssea dos pacientes em investigação de neoplasias mieloproliferativas, por RT-PCR, para exclusão dos casos BCR/ABL positivas (LMC); Detectar a mutação JAK2V617F nas amostras de sangue total dos pacientes em investigação de neoplasias mieloproliferativas BCR/ABL negativos, por PCR alelo específico; Analisar a expressão da proteína antiapoptótica survivina nas biópsias de medula óssea dos pacientes BCR/ABL negativos por imunohistoquímica; LOEH

Objetivos específicos Associar a expressão da mutação JAK2V617F com o subtipo de NMP observado na avaliação clínica, resposta ao tratamento e evolução da doença; Avaliar a importância da detecção da mutação JAK2V617F e sua associação com a proteína antiapoptótica survivina no diagnóstico diferencial, no prognóstico e no monitoramento terapêutico dos pacientes com NMP. LOEH

Metodologia : Aspectos éticos O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC (Protocolo de pesquisa no 150/09) e do Centro de Pesquisas Oncológicas - CEPON (Protocolo de pesquisa no 016/2010). Participaram do estudo somente os pacientes que concordaram em participar do mesmo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. LOEH

Metodologia: População do Estudo No período de Janeiro 2010 a Dezembro de 2011 foram avaliadas as amostras de sangue periférico e/ou medula óssea de todos os pacientes com suspeita clínica de neoplasias mieloproliferativas NMP referenciados ao Hospital Universitário da UFSC (referência para neoplasias hematológicas/SUS/SC), num total de 305 amostras. Após a coleta, as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias para análise no máximo até duas horas após a coleta, onde foram realizados os seguintes procedimentos laboratoriais. LOEH

Pesquisa da translocação(9;22) Metodologia Pesquisa da translocação(9;22) Transcrição reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) LOEH

Pesquisa da translocação(9;22) Metodologia: Pesquisa da translocação(9;22) van DONGEN et al., 1999 LOEH

Pesquisa da translocação(9;22) Metodologia: Pesquisa da translocação(9;22) Transcrito b3-a2 (frequência 55%) C A Éxon 14 Éxon 2 Éxon 3 Éxon 4 BCR ABL > B E3’ 521pb 445pb van DONGEN et al., 1999 LOEH MORAES, A.C.R.

Pesquisa da translocação(9;22) Metodologia: Pesquisa da translocação(9;22) LOEH

Pesquisa da Mutação JAK2V617F Metodologia Pesquisa da Mutação JAK2V617F Reação em Cadeia da Polimerase alelo específico (PCR alelo específico) LOEH

Pesquisa da Mutação JAK2V617F: PCR alelo específico Utilização de 3 primers: F1 (alelo normal) 5’ - ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG – 3’   F2 (alelo mutante) 5’ - AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT – 3’ R1 5’ - CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA – 3’ Como mencionado anteriormente, foram utilizados na reação de PCR 3 primers: O F1 que é específico para um alelo normal presente tanto em pacientes saudáveis como em pacientes com mutação. O F2 que é específico para o alelo mutante. E o R1 que é o primer reverso comum aos 2 primers mencionados acima CAMPBELL et al., (Methods in Molecular Medicine) LOEH

Alelo JAK2 do tipo “selvagem” Métodos Alelo JAK2 do tipo “selvagem” F1 G R1 364pb Alelo JAK2 V617F F2 F1 T O primeiro par de primers amplifica o gene da jak2 independentemente da presença de mutação ou não, enquanto o segundo par de primers se liga apenas na região mutada. Nesse esquema pode ser visualizado como funcionam os 3 primers na reação. No quadro acima temos a representação da gene JAK2 normal e abaixo temos o gene JAK2 mutado, com a timina ao invés da guanina. Como pode ser observado o primer F1 pareia com uma sequencia presente em todos os indivíduos, bem antes do local da mutação no gene JAK2. formando um produto de 364 pb com o primer R1. Já o primer F2 vai parear somente na presença na mutação, formando um produto de 203 pb com o primer R1 R1 F1 F2 R1 364pb 203pb CAMPBELL et al., (Methods in Molecular Medicine) MORAES, A.C.R.

Pesquisa da Mutação JAK2V617F: PCR alelo específico BARCELOS, 2011 Portanto a revelação dos produtos dessa PCR em gel de agarose acontece da seguinte forma: presença de uma banda nos indivíduos normais (a de 364pb) e presença de 2 bandas nos indivíduos mutados (a de 364 pb e a de 203pb) LOEH

Expressão da proteína antiapoptótica survivina Metodologia Expressão da proteína antiapoptótica survivina Reação de Imunohistoquímica LOEH

Expressão da Proteína Survivina: Imunohistoquímica DAB + H2O2 P Streptoavidida conjugada DAB + H2O + O. Ac secundário biotinilado Ac primário Epítopo da proteína

Análise da expressão da proteína antiapoptótica survivina nas biópsias de medula óssea. Positivo Negativo LOEH

Análise dos prontuários Metodologia Análise dos prontuários Idade Sexo Contagem de eritrócitos Contagem de leucócitos Contagem de plaquetas Hematócrito Concentração de hemoglobina Trombose Esplenomegalia LOEH

Metodologia: Avaliação estatística A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste “t” de Student não pareado. Os valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. LOEH

Resultados e Discussão: Detecção da mutação JAK2V617F Foram encaminhadas ao LOEH, 305 amostras com suspeita de NMPC (jan/2010 a dez/2011) 64 pacientes obtiveram o diagnóstico de PV, TE ou MFP 25 casos (39%) foram negativos para a mutação JAK2V617F 39 casos (61%) foram positivos para a mutação JAK2V617F LOEH

Resultados e Discussão: Distribuição dos casos com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa que foram submetidos à investigação da mutação JAK2V617F, de acordo com a idade Mutação JAK2V617F Mediana da idade (anos) Desvio Padrão Idade mínina (anos) Idade máxima (anos) P Ausência 50 14,2 19 74 0,018* Presença 60 16,6 31 89 A mutação JAK2V617F mostrou-se mais frequente em indivíduos mais idosos LOEH

Resultados e Discussão: Frequência de esplenomegalia nos pacientes com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa distribuídos de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F. Dados Clínicos Ausência da mutação Presença da mutação P Indivíduos Com esplenomegalia 7 (46,7%) 8 (53,3%) 0,55 Sem esplenomegalia 18 (36,7%) 31 (63,3%) Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e a ocorrência de esplenomegalia LOEH

Resultados e Discussão: Frequência de trombose nos pacientes com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa distribuídos de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F Dados Clínicos Ausência da mutação Presença da mutação P Indivíduos Com trombose 2 (22,2%) 7 (77,8%) 0,46 Sem trombose 23 (41,8%) 32 (58,2%) Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e a ocorrência de trombose. LOEH

Resultados e Discussão: Frequência dos subtipos de NMPCs BCR/ABL negativas de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F Mutação JAK2V717F Subtipo da doença Negativo Positivo Total MFP 4 (44,4%) 5 (55,6%) 9 PV 5 (27,8%) 13 (72,2%) 18 TE 16 (43,2%) 19 (56,8%) 37 25 39 64 Esses resultados podem fornecer informações sobre a prevalência de cada subtipo de NMPC BCR/ABL negativa na região da Grande Florianópolis LOEH

Resultados e Discussão: Frequência dos subtipos de NMPCs BCR/ABL negativas de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F Mutação JAK2V717F Subtipo da doença Negativo Positivo Total MFP 4 (57,1%) 3 (42,9%) 7 PV 4 (28,6%) 10 (71,4%) 14 TE 14 (42,4%) 19 (57,6%) 33 22 32 Variações na frequência da mutação JAK2V617F: MFP: 35% a 57% PV: 65% a 97% TE: 23% a 57% LOEH

Resultados e Discussão: Mutação JAK2V617F P Negativo Positivo MIELOFIBROSE PRIMÁRIA Idade, mediana ± intervalo (anos) 65,0±(56-74) 67,8±(69-74) 0,570 Eritrócitos, média ± DP (x106/mm3) 3,5±1,0 4,7±0,9 0,429 Hemoglobina, média ± DP (g/ml) 9,3±1,7 15,4±4,3 0,118 Hematócrito, média ± DP (%) 28,9±4,9 42,5±15,1 0,129 Leucócitos, média ± (/mm3) 12290±13.933 17518±10.362 0,242 Plaquetas, média ± (/µl) 157000±77.476 307240±162.775 0,136 A mutação JAK2V617F não está associada à ocorrência de anormalidades laboratoriais nos indivíduos com MFP

LOEH Mutação JAK2V617F P Negativo Positivo POLICITEMIA VERA Idade, mediana ± intervalo (anos) 40,7 54,1 0,212 Eritrócitos, média ± DP (x106/mm3) 6,0±0,5 6,9±1,1 0,181 Hemoglobina, média ± DP (g/ml) 17,1±1,5 19,5±3,9 0,328 Hematócrito, média ± DP (%) 52,3±2,2 57,9±5,7 0,078 Leucócitos, média ± (/mm3) 20247±25268 13813±5537 0,936 Plaquetas, média ± (/µl) 254000±96957 426230±130478 0,029 LOEH

Mutação JAK2V617F P Negativo Positivo TROMBOCITEMIA ESSENCIAL Idade, mediana ± intervalo (anos) 48,5 61,8 0,002* Eritrócitos, média ± DP (x106/mm3) 4,2±0,5 4,8±1,2 0,107 Hemoglobina, média ± DP (g/ml) 13,1±1,6 13,7±2,1 0,140 Hematócrito, média ± DP (%) 38,7±5,1 44,0±10,1 0,022* Leucócitos, média ± (/mm3) 7715±2176 12321±5983 0,001* Plaquetas, média ± (/µl) 850312±399657 916571±281370 0,333 Esses resultados sugerem que há associação da mutação com a expansão da linhagem mielóide

Conclusões: A mutação JAK2V617F apresentou alta prevalência (61%) nos pacientes com NMPC BCR/ABL negativa referenciados ao Hospital Universitário da UFSC. O subtipo de NMPC BCR/ABL negativa de maior prevalência nos pacientes referenciados ao Hospital Universitário da UFSC foi a TE (61%). LOEH

Conclusões: Houve uma associação estatisticamente significativa entre a presença da mutação JAK2V617F e os indivíduos mais idosos, o que a caracteriza como adquirida. Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e eventos trombóticos de modo geral. Não houve associação entre a presença da mutação e a ocorrência de esplenomegalia. LOEH

Conclusões: A presença da mutação JAK2V617F nem sempre está associada com a ocorrência de anormalidades laboratoriais (contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas, concentração de hemoglobina e índice de hematócrito) nos indivíduos com NMPC BCR/ABL negativa. A expressão da proteína survivina não foi detectada nas biópsias de medulas ósseas dos indivíduos deste estudo, portanto, a investigação da expressão da proteína survivina não serve como um bom marcador para o diagnóstico dos pacientes com NMPC BCR/ABL negativa.

Impactos do Projeto – Científico Implementação desta metodologia moderna de diagnóstico, que não é realizada pelos laboratórios que atendem SUS, foi importante para o diagnóstico e prognóstico de neoplasias mieloproliferativas. Além disso, permitiu o desenvolvimento de projetos com tecnologia avançada e com resultados de impacto. Consolidação de um grupo de pesquisa multiprofissional, o qual vem buscando integração entre a pesquisa, o ensino e assistência, e, é pioneiro no Estado de Santa Catarina na área de diagnóstico laboratorial hematológico e pela junção das linhas de investigação clínica e laboratorial. Formação de recursos humanos: estudantes de graduação (iniciação científica) e pós-graduação qualificados. Uma dissertação de mestrado foi concluída em Fevereiro de 2011 e um estágio de iniciação científica finalizado em 2010.

Produção Científica (Artigos em periódico indexado) BARCELOS, MM; SANTOS-SILVA, MC. Molecular approach on diagnosis of BCR/ABL negative chronic myeloproliferative neoplasms. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, V 33 pg 296, 2011. BARCELOS, M. M. ; MORAES, A. C. R.; REIS, M. L.; I-CHING, L.; MORAL, J.A.G.D.; SILVA, R.M.; BAZZO, M.L.; SANTOS-SILVA, M. C. Association between JAK2V617F mutation and clinical and laboratorial findings in patients with BCR-ABL-negative chronic myeloproliferative neoplasms. Submetido na Revista Annal of Clinical Biohemistry . LOEH

Produção Científica: Dissertação de Mestrado BARCELOS, M. M. Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F em Pacientes com Neoplasia Mieloproliferativa Crônica BCR/ABL negativa e sua Associação com a Expressão da Proteína Antiapoptótica Survivina como Marcador Diagnóstico.2011. 138 p. Dissertação (Mestrado em Farmácia)- Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis LOEH

Produção Científica: Resumos publicados em Anais de Congresso BARCELOS, MM; MORAES, ACR; LIRA-REIS, M; DEL MORAL, JAG; I-CHING, L; BAZZO, ML; SANTOS-SILVA, MC. Diagnóstico de Neoplasias Mieloproliferativas clássicas BCR/ABL negativas segundo os critérios da OMS-2008. In: Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia, 2010, Brasília. Resumo publicado na Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, 2010. v. 32. p. 140. BARCELOS, M. M. ; REIS, M. L. ; MORAES, A. C. R.; MORAL, J.A. Gonzaga D.; I-Ching, Lee ; BAZZO, M.L.; SANTOS-SILVA, M. C. Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F em Pacientes com Neoplasia Mieloproliferativa Crônica BCR/ABL negativa In: Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia, 2011, São Paulo. Resumo publicado na Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, 2011. v. 33. p. 141. LOEH

Impactos do Projeto – Econômico/Social Indubitavelmente, após a implementação dessa metodologia diagnóstica na rotina dos laboratórios clínicos de referência em hemopatias malignas, que fazem atendimento pelo SUS, como o HU-UFSC, teremos uma melhoria da qualidade de vida dos pacientes atendidos. O Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias da UFSC é o único laboratório público de Santa Catarina que realiza estes exames para os pacientes do SUS. Atendemos solicitações de várias cidades do Estado. Sendo assim, acreditamos que estamos contribuindo com o desenvolvimento regional na área de diagnóstico laboratorial. LOEH

Aplicabilidade para o SUS Com a implementação dessa metodologia para o diagnóstico diferencial de neoplasias mieloproliferativas na rotina dos laboratórios clínicos de referência em hemopatias malignas, que fazem atendimento pelo SUS, certamente teremos um diagnóstico laboratorial mais ágil e eficiente, o que implica na redução do tempo para o diagnóstico clínico e na decisão do tratamento mais adequado. Isso diminui os custos do SUS e aumenta a cobertura de serviços. LOEH

LOEH HCPr: 11 Blumenau: 20 Rio do Sul: 1 Videira: 1 HU: 202 CEPON: 62 HEMOSC: 36 HGCR: 02 HRSJ: 19 Criciúma: 48 LOEH http://www.guianet.com.br/sc/mapasc.htm

Considerações Finais LOEH A descoberta da mutação JAK2V617F foi fundamental para estabelecer ideias cruciais ao entendimento da base genética das NMPCs, porém muitas questões ainda permanecem sem resposta. Apesar de trabalhos na literatura fornecerem uma ideia de como uma única mutação pode resultar em três fenótipos diferentes, estudos ainda são necessários para determinar marcadores moleculares específicos para cada subtipo de NMPC. Considerações Finais Apesar da metodologia já ter sido implementada num laboratório de pesquisa, o SUS precisa criar um código de pagamento para os laboratórios clínicos públicos que executem esta análise possam dar continuidade as atividades iniciadas com esse projeto. Com a continuidade do projeto teremos as informações epidemiológicas da frequência dos subtipos de NMPc no Estado de Santa Catarina. Esses dados são importantes para o planejamento de custos com essas doenças. LOEH

OBRIGADA ! LOEH