Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers
1-Introdução Kary Mullis 1985 – Cetus Corporation A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo”de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas
2-Automatização da PCR O isolamento da DNA polymerase termoestável da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polymerase. Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador
2-Automatização da PCR Termociclador
Etapas básicas da PCR: 2-Automatização da PCR 1- desnaturação térmica do DNA molde 2- Anelamento de oligonucleotídeos sintéticos – iniciadores 3- Polimerização das novas fitas a partir dos iniciadores
3-Sistema de reação Em um microtubo... DNA a ser amplificado (pequenas quantidades) Solução tamponada contendo: DNA polimerase Iniciadores dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Cofator enzimático MgCl2 Água milliQ
4-Iniciadores - primers Tamanho – entre 10 a 30 bases Composição de bases - ~50% de G/C Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular Cálculo da Tm
Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores 4-Iniciadores - primers Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores Do inglês: melting temperature Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio Para o cálculo: Tm= 2(A+T) + 4(G+C)