Depto. De Fisiologia e Biofísica

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1 Depto. De Fisiologia e Biofísica
Sinalização intracelular na ilhota pancreática materna durante o período perinatal Silvana Bordin Depto. De Fisiologia e Biofísica ICB - USP

2 Homeostase glicêmica Resitência à insulina Aumento da secreção

3 Alterações da secreção de insulina durante a gravidez e lactação
Gravidez normal Demanda Nutricional + Hormônios Diabetogênicos Resistência periférica secreção de insulina Hiperinsulinemia e normo- ou hipoglicemia

4 Hiperglicemia materna Hiperinsulinemia fetal
Diabetes Mellitus Gestacional (GDM) Resistência periférica sem compensação da resposta secretora de insulina Hiperglicemia materna + Hiperinsulinemia fetal

5 Adaptações da ilhota pancreática na gestação
Histórico: Aumento da massa da ilhota (1930) (Akehi T. Apud Hellman B, Acta Obstr Gynec Scandinav.39: , 1960) Aumento da secreção de insulina (60’) (Spellacy , 1962; Malaisse ; 1969; Green & Taylor, 1972) Lactogênio Placentário & Prolactina (80’) (Nielsen, 1982; Sorenson, 1985; Boschero, 1993) Glut2, HK, cAMP, Ca2+, K+, CX, etc

6 Vias de sinalização da Prolactina
Bole-Feysot et al. Endocrine Reviews, 1998

7 basal; stimulated J Endocrinol, 2004 Control Pregnant
10 20 30 Insulin secretion (ng/islet/h) * S AS S AS basal; stimulated

8 Protein Phosphorylation
Ativação das vias PI3K/AKT e MAPK pela PRL Arbitrary densitometric Protein Phosphorylation S AS p-AKT * Pp70S6K control; pregnant

9 Genes-alvo (?) Efeitos Biológicos
Aumento da secreção de insulina na gestação é dependente da ação da Prolactina PRL Efeitos Biológicos ATP JAK2 STAT5 Genes-alvo (?) Secreção de insulina Crescimento celular

10 Effectors & intracellular
Mol Cell Endocrinol, 2004 Cell cycle regulators Cyclins D1, D2 PCNA CDK 4 p27kip-1 EIF-2 Translation 40 S & 60 S Ribosomal proteins (4) Transcription factors c-jun Max Others TRH MIF SST CD24 NSE Cu/Zn SOD CAM Exocytosis Synaptotagmin IV Secretogranin V CaBP2 Effectors & intracellular transducers MEK 2 ERK-1,-2, -3 AKT-2 I-kappa B LAR zeta/delta STAT3 AKT-1 Receptors & Transporters TNF-R1 IL1-R1 IL6-R IGF2-R BMP-R ACh-R Na/K ATPase PRL

11 Receptors & transporters Effectors & intracellular
Gestação prohormone convertase 1 Exocytosis Cell cycle regulators Receptors & transporters Cyclins D3 PCNA Effectors & intracellular transducers ERK -3 I-kappa B VDCC CaBP2 Translation 40 S & 60 S Ribosomal proteins (3) Transcription factors c-jun Max STAT3 Others TRH CD24 Cu/Zn SOD c-fos Jun-D IL1-R1, IL6-R IGF2-R, IGF1-R BMP-R ACh-R PGD2-R GRP-R Proteasome C3 GLUR2 & 8 GLUT-1 & 2 CREBP PMCA nur77 GH-R AKT -1

12 ERK3 Isoformas p97 e p63 Localização nuclear e citoplasmática
Membro atípico da família das MAPKs Isoformas p97 e p63 Localização nuclear e citoplasmática Função ? (ciclo celular) Ativação ? (PKC) MAPK = Mitogen-Activated Protein Kinase Microtubule-Associated Protein Kinase

13 ERK3 participa do processo de secreção de insulina
Mol Cell Endocrinol, 2006 Insulin ERK3 Insulin/ERK3 Glucose 5.6 mM Glucose 11.1 mM 100 200 SO-ERK3 ASO-ERK3 CTL # IP: Map2 IB: p-Ser IB: Map2 ASO-ERK3 CTL * Vehicle PMA 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 phospho serine/Map2 ratio ERK3 participa do processo de secreção de insulina Mecanismo proposto: ativação de proteínas reguladoras do rearranjo de microtúbulos

14 STAT3 KO-STAT3 (mamária): retarda a involução
IL6: estimula proliferação e expressão da insulina Leptina: inibe síntese e secreção de insulina KO-STAT3 (mamária): retarda a involução

15 A secreção de insulina volta aos valores normais já no terceiro dia de lactação
Kawai and Kishi, 1999

16 Expressão e Fosforilação do STAT3 na gestação e lactação

17 STAT3-insKO BBRC, 2004

18 Supressão da 1ª fase da secreção na lactação

19 Primeira fase da secreção de insulina

20 Expressão diminuída de SERCA2 em ilhotas pancreáticas está associada à diminuição da oscilação de [Ca2+]c, consumo de O2 e secreção de insulina frente ao estímulo com glicose. Kulkarni et al., 2004 SERCA2 (mas não SERCA3) está envolvida na regulação do [Ca2+]c de repouso das células b, o que indica que SERCA2 é a principal Ca2+-ATPase do ER em condições fisiológicas. (Varadi & Rutter 2002).

21 Expressão de SERCA em ilhotas de ratas grávidas e lactantes

22 STAT3-ASO reproduz os efeitos observados em animais STAT3-insKO

23 STAT3-knockdown previne o aumento de expressão de SERCA2 e IP3R induzido por PRL
0,4 1,0 0,6 1,2 0,2 1,4 0,8 IP3R / RPL37a ratio CTL PRL ASO ASO+

24 Níveis circulantes de PRL permanecem altos
em ratas no início da lactação Gestação Lactação Kawai and Kishi, 1999

25 Dexametasona diminui os efeitos da PRL sobre
a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas de ratas Weinhaus et al., 2000

26 Dexametasona modula negativamente a fosforilação
em serina induzida por PRL do STAT3 em células RINm5F

27 Dexametasona modula negativamente o efeito da PRL sobre a expressão de SERCA2 em ilhotas pancreáticas

28 Conclusões A fosforilação em serina do STAT3 e a expressão de SERCA dois aumentam no fim da gestação e retomam valores normais já no 3º dia de lactação. O efeito positivo da PRL sobre a expressão de SERCA2 é dependente do STAT3. A DEX regula negativamente a ação da PRL sobre a fosforilação em serina do STAT3 e expressão de SERCA2 STAT3-regulated SERCA2 expression by prolactin and glucocorticoids is involved in the adaptation of insulin secretory response during the peripartum period. Anhê GF, Nogueira TCA, Nicoletti-Carvalho JE, Lellis-Santos C, Cipolla-Neto J, Bosqueiro JR, Boschero AC, Bordin S. J. Endocrinol (submetido)

29 Expressão e fosforilação de proteínas da via da AKT em ilhotas pancreáticas de ratas grávidas e lactantes

30 Expressão e fosforilação das ERKs 1 e 2 em ilhotas pancreáticas de ratas grávidas e lactantes

31 Dexametasona contrapõe o efeito da PRL sobre a fosforilação de ERK1/2

32 Expressão de fosfatases reguladoras das vias da AKT e ERK 1/2 em ilhotas de ratas lactantes

33 Expressão de fosfatases reguladoras das vias da AKT e ERK 1/2 em células RINm5F tratadas com DEX

34 Conclusão Os glicocorticóides estimulam a expressão da fosfatase MKP-1 e consequentemente regulam negativamente a fosforilação das ERK 1/2. Este mecanismo deve estar envolvido na regressão ao estado basal de ilhotas de ratas grávidas, que ocorre no início da lactação.

35 Laboratório de Biologia Molecular
Silvana Bordin Gabriel F. Anhê José Edgar N. Carvalho Camilo de Lellis Santos Tatiane C. de Araújo Nogueira Luciana C. Caperuto Rui Curi José Cipolla Neto Carla R. O. Carvalho Andrea S. Torrão Angelo R. Carpinelli A. C. Boschero M. Esméria. C. Amaral José Roberto Bosqueiro Licio A. Velloso (11)