ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS BIOMEDICINA FIEL DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO

Reações imunoquímicas ANTÍGENO + ANTICORPO Reação química especial Reconhecimento do antígeno: Superfície da célula Disperso em solução Anticorpos Especificidade Afinidade Diversidade

Técnicas (métodos) utilizados Reagentes não marcados Precipitação (Floculação) e derivados Aglutinação Reagentes marcados Radioativos - RIA = Radio-imunoensaio IRMA – Ensaio Imunoradiométrico Não radioativos Enzimáticos: 1970- ELISA e seus “derivados” = EIA, EMIT, Fluorescentes: FPIA, ELFA , FSF, Imunofluorescência Quimioluminescentes : convencional, ou eletroquimioluminescência] Blotting

Reações de Precipitação Quantificação do precipitado (COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO) Fatores interferentes: Concentrações do antígeno e do anticorpo Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos componentes: FENÔMENO PR0-ZONA Precipitação máxima: concentrações equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)

Reações de Precipitação Direta: Clássica: VDRL – RPS – SÍFILIS OU LUES DERIVADAS MANUAIS Imunodifusão Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixação Eletroimunodifusáo DERIVADAS AUTOMATIZADAS NEFALOMETRIA E TURBIDIMETRIA

Nefalometria e Turbidimetria Possibilidade de Automação total Nefalômetros Equipamentos de bioquímica Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) Fator Reumatóide Microalbumina Proteína C Reativa Apoliproproteína

Reações de Aglutinação Formação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículas Detectam tanto a presença de IgM quanto de IgG Visualização: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:

Reações de Aglutinação Fatores interferentes: Classe do Anticorpo envolvido; Eletrólitos; Macromoléculas Hidrofílicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; Temperatura

Falso Negativas Quantidade pequena de anticorpos: a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando; Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)

TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS Determinantes antigênicos Naturais: Hemácias – determinação grupo sangüíneo Bactérias – SLIDEX meningites Protozoários Particulas inertes revestidas Látex (mais comum) Gelatina Betonita, polipeptídeos Células antigenicamente não relacionadas Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados Hemácias e bactérias

Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas Aglutinação direta : ex teste de gravidez Aglutinação passiva Hemaglutinação direta: ABO RH Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose Hemaglutinação Passiva Inibição de Hemaglutinação Inibição de Hemaglutinação passiva

Imunofluorescência Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno. Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato de Fluoresceína* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)

Imunofluoresência direta A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência Pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)* microscópio de fluorescência

IFI – Imunofluorescência INDIRETA A- pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac * • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * • microscópio de fluorescência • * lavagens B- pesquisa de anticorpos • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac * • microscópio • determinação do título e classe do Ac

Imunoensaios competitivos Há competição entre a substância presente na amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA).

Imunoensaios NÃO COMPETITIVOS São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico

TIPOS Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiométrico (IRMA) Enzimaimunoensaio (EIA) Imunofluorimétrico (IFMA, FPIA, ELFA) Quimioluminescencia (ICMA)

Ensaios Enzimáticos, Fluorescentes ou Quimioluminescentes : Competitivos Não competitivos Sequenciais Sanduíche Fatores Interferentes: Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais. Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais

Fatores interferentes II Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.

ETAPAS ELISA, EIA sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Ac bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * adição da amostra (em diluente) * adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupção da reação: SDS ou ácido leitura: leitor de ELISA * lavagens

QUIMIOLUMINESCÊNCIA Pra que serve??? Qual vantagem? UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) HORMÔNIOS DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTEÍNA VANTAGENS: Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente