PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico Vera Luiza Capelozzi Departamento de Patologia Faculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil e-mail: vcapelozzi@lim05.fm.usp.br

Imunofluorescência Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre definição morfológica Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e embebição em parafina

IHQ: Tipos de Anticorpos Monoclonais e policlonais monoclonais: mais específicos policlonais: reconhecem diversos epítopos injeção de um antígeno peptídico em animais após a estimulação de resposta imune secundária isolamento dos anticorpos a partir do soro Primários e secundários primários: antígeno de interesse e são não-marcados anticorpos secundários produzidos contra anticorpos primários reconhecem IGs de uma espécie particular e são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight

IHQ: Preparação das Amostras Cortes: finos 4μm , micrótomo lâminas Controles padronização processamento e fixação “Controles internos”: tecido (ou células) da mesma secção secção do mesmo espécime da paciente “Controles externos”: tecidos (ou linhas de células) de outras fontes células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão

IHQ: Direta e Indireta Direto (one-step) anticorpo marcado (e.g. Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) conjugado reage diretamente com o antígeno no tecido simples e rápido baixa sensibilidade: pequena amplificação de sinal

Ac primário não-marcado (primeira camada) + Ag do tecido + Ac secundário marcado (segunda camada) contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima Método mais sensível: amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios antigênicos do Ac primário Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos Método direto: produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse

HE & IHQ

IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada órgão de origem de uma neoplasia diferenciada subtipagem de neoplasias (linfomas) fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos (por exemplo, hormônios) identificação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células detecção de células neoplásicas metastáticas diferenciação proliferação celular maligna e benigna

IHQ: Marcadores diagnósticos técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido maior desvantagem ao contrário do immunoblotting: coloração checada contra um peso molecular impossível mostrar que a coloração corresponde à proteína de interesse Acs primários devem validados por Western Blot

Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas CD45 (LCA): marcador de leucócitos; HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma; S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas); Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros; Alfafetoproteína (AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular; BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas; CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama; Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata; Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama; CD3 (Pan-T): linfomas de células T; CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares; CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais; CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas CD20 (Pan-B): linfomas de células B; CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário; CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos; CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel; Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina; Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama; KI-67: marcador de proliferação celular; Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.

CK-7 Caspase-9 TTF1 CD56 Bcl-2 MMP-9 AE1+AE3 CD1a P63 Vimentina IL-4 CD3 CD68

Câncer de Pulmão: Tipos Histológicos Classificação WHO 2004 – Tipos Maiores1 *Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis Outros* 24.0% Adenocarcinoma 38.3% LCC 5.0% SCLC 13.0% 19.7% SqCC Percentual distribuido entre casos classificaveis, 2001-20042 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC): Tipos Histológicos Adenocarcinoma 19% Carc Cels Escamosas Carc Grandes Células 38% Não Especificado (NOS) 14% 29% I would like to come back to this issue about not otherwise specified non-small-cell lung cancer. These are data from the American Cancer Society, and you can see approximately 20% of all non-small-cell lung cancer cases have been classified by pathologists as not otherwise specified. Now, in reality these tumors by and large are of one cell type or the other. A small number of them are actually so poorly differentiated that you would never be able to tell. But in most cases you can tell, if we have adequate tissue. So again, to repeat myself this means we need more and more, if we do a fine needle to do multiple passes, or to obtain a core biopsy at a minimum so that we can both define histology and do molecular analysis. 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

NSLCL: 70% Apresentação como Doença Avançada

Análise molecular de adenocarcinomas Sem mutação KRAS 22% AKT1 EGFR 17% NRAS MEK1 MET AMP EML4-AKL 7% HER2 Now, this is being done by other groups as well, and this is data that was presented at the World Conference by Bruce Johnson and his colleagues from the Lung Cancer Molecular Consortium. And it shows that in 54% of lung adenocarcinomas that were analyzed, an actionable driver mutation or abnormality was found, so this is the answer to the question I asked you earlier about in what percentage of cases would you find some actionable abnormality?   And in this study they referred patients to appropriate biomarker driven clinical trials, based on the specific analysis. PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

Alvos moleculares potencialmente “tratáveis” Alvos emergentes “tratáveis” em CA Celulas Escamosas de pulmão Alvos emergentes “tratáveis” em Adenocarcinoma de pulmão K-ras EGFR B-raf HER2 PIK3CA ALK MET Other Gene Evento Frequencia, % FGFR1 Amplificação 20-25 FGFR2 Mutação 5 PIK3CA 9 PTEN Mutação-deleção 18 CCND1 8 CDKN2A Deleção/mutação 45 PDGFRA Amplificacão-mutação EGFR 10 MCL1 BRAF 3 DDR2 Mutacão 4 ERBB2 2 This slide shows some data regarding adenocarcinoma on the left, and then on the right are brand new data that were presented by Hammerman et al at our 2011 World Conference on Lung Cancer. And it displays what we call potential druggable molecular targets. Now, for adenocarcinoma we have already talked about some of these, such as EGFR or ALK. But what I want to draw your attention to is that squamous cell carcinoma, which was a black box, in other words molecularly they looked pretty much the same. We are now realizing that they are also very different from case to case. For example, for genes such as fibroblast growth factor receptor or a number of other abnormalities here, there are mutations or amplifications or deletions which could dictate therapy. There are a number of fibroblast growth factor inhibitors now in development, for example, that we know in animal models are very effective in treating squamous cell carcinomas with amplification of this gene.   So we will find out within the next few years the clinical applicability, but the point here is that I think more and more we will be individualizing therapy, even for squamous cell subtypes. Outro (Indeterminado) Bang Y, et al. ASCO 2010. Abstract 3. Hammerman P, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract PRS.1

IHQ: Marcadores Diagnósticos Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas TTF1 p63 Travis WD; USCAP 2012

IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor Mutation in epidermal growth factor receptor Top=fl uorescent in-situ hybridisation (FISH) EGFR gene amplifi cation (red clusters) and centromere, chromosome 7 (green). Middle=protein expression by immunohistochemistry (Dako, Glostrup, Denmark). Bottom=EGFR mutation in exon 21. Protein expression by immuno-histochemistry for epidermal growth factor receptor Qual Material? Huber Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009) Amsterdam, 26. 9. 2011

Patologia Cirúrgica: Rotina O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer? - biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? - fatores que influenciam as análises moleculares Como Atender ao que o Patologista pode fazer? Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?

Kevin L, USCAP 2012

Kevin L, USCAP 2012

Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas

Histologia: grupo de células incluso maligno “não pequenas” células não favorece adenocarcinoma pela morfologia Recomendável IHC para confirmar origem pulmonar Resultados: TTF1 neg, CK7 pos Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40... Laudo: “carcinoma não pequenas células, NOS”, clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama... ... se for, recomendável pesquisa de Her2neu

Se pensarmos: mais a favor de adenocarcinoma precisamos saber se trata de AIS Se não: como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa recomendamos pesquisa de EGFR e ALK

Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão Pequenas Células (SCLC) 15% de todo câncer de pulmão incidência em declínio Não-Pequenas Células (NSCLC) 80% de todo câncer de pulmão tipos de NSCLC : células escamosas adenocarcinoma grandes células

Carcinoma não-pequenas células Adenocarcinoma - padrão glandular mucina positiva (50%) CK7+/CK20- TTF1+ Napsin A Carcinoma células escamosas queratinização celular pontes intercelulares escamas córneas CK7-/CK20- P63+ CK5/6+ WHO Comum, mas não 100% WHO Comum, mas não 100%

NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA

NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA TTF1 TTF1

NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR Travis W, USCAP 2012

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA- BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012

MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO Travis W, USCAP 2012

EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

Análise molecular de adenocarcinomas Sem mutação KRAS 22% AKT1 EGFR 17% NRAS MEK1 MET AMP EML4-AKL 7% HER2 Now, this is being done by other groups as well, and this is data that was presented at the World Conference by Bruce Johnson and his colleagues from the Lung Cancer Molecular Consortium. And it shows that in 54% of lung adenocarcinomas that were analyzed, an actionable driver mutation or abnormality was found, so this is the answer to the question I asked you earlier about in what percentage of cases would you find some actionable abnormality?   And in this study they referred patients to appropriate biomarker driven clinical trials, based on the specific analysis. PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão Quantificação da Expressão do EGFR FLEX Baixa EGFR IHC score <200 N=776; 69% Alta EGFR IHC score ≥200 N=345; 31% IHC score=0* IHC score=112 IHC score=270 Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão Huber Amsterdam, 26. 9. 2011 Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06 *This field 39

EGFR-Anticorpo – FLEX Chemotherapy + Cetuximab Chemotherapy Maintenance NSCLC wet IIIB/IV EGFR- expressing Chemotherapy + Cetuximab Cetuximab until PD or intolerable toxicity Chemotherapy Chemotherapy (CT) Cetuximab Cisplatin 80 mg/m2 day 1 Vinorelbine 25 (30) mg/m2 days 1, 8 Every 3 weeks, up to 6 cycles initial dose 400 mg/m2 then 250 mg/m2 weekly Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Amsterdam, 26. 9. 2011 Huber

FLEX: sobrevida Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31 Median OS 1-year survival CT + cetuximab (n=557) 11.3 mo 47% CT (n=568) 10.1 mo 42% No effect of kRAS-Mutation and EGFR-FISH O'Byrne P ea. ASCO 2009 CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Amsterdam, 26. 9. 2011 Huber

Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345) Survival Median 1-year 2-year CT + cetuximab 12.0 mo 50% 24% CT 9.6 mo 37% 15% HR*=0.73 [95% CI 0.58–0.93], p=0.011† 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Overall survival (%) 18 6 12 24 30 Months Number of patients at risk Number of patients at risk Number of patients at risk CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT 167 108 11 58 36 CT 167 108 11 58 36 Huber Amsterdam, 26. 9. 2011 *When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank

CONCLUSÃO OBRIGADA!! Medicina Personalizada do Paciente Câncer de Pulmão Avançado deve ser Direcionada para Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR) OBRIGADA!!