Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers
A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas.
Introdução 1985 – Primeira Publicação - Science Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K. Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim. Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA multiplicado milhares de vezes – amplificação 1993 – Prêmio Nobel em Química Kary Mullis
Ciclos da PCR - Gráfico 1˚ Ciclo 2˚ Ciclo Etapa 1: DESNATURAÇÃO 94-96˚C por 30’ Etapa 2: ANELAMENTO 50- 65˚C por 1min Etapa 3: POLIMERIZAÇÃO 72˚C por 1min 1˚ Ciclo 2˚ Ciclo Número de ciclos numa reação: 30 a 35
Taq DNA Polimerase Bactéria termoestável Thermus aquaticus
Automatização da PCR Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador Termociclador
Componentes da PCR Mg 2+ Taq Polimerase Tampão 10x dCTP H20 Milli-Q dGTP dNTP dATP Iniciadores: Forward/Reverse dTTP
4-Iniciadores - primers Tamanho – entre 10 a 30 bases Composição de bases - ~50% de G/C Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular Cálculo da Tm
4-Iniciadores - primers Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores Do inglês: melting temperature Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio Para o cálculo: Tm= 2(A+T) + 4(G+C)
Aplicações: Medicina forense; identificação de patógenos (diagnóstico molecular); Genótipos (identificação de vírus, p. ex.)