Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidas BIO10-329 Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidas Os assuntos abordados nessa aula são: Modelos de estrutura proteica Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas Métodos de estudo da estrutura de proteínas Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior: Subunidades alfa Subunidades beta Heme (grupo prostético) A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas

. Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo: Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica; mantida por ligações peptídicas aminoácido É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N-C-Ca-)n na proteína. Estrutura secundária: Enovelamento de partes da cadeia polipeptídica Formada somente pelos átomos da ligação peptídica, através de pontes de H. Ex: alfa-hélices e folhas beta. Estrutura quaternária: Associação de mais de uma cadeia polipeptídica No modelo, um tetrâmero composto de 4 cadeias polipeptídicas x 4 Estrutura terciária: Enovelamento de uma cadeia polipeptídica como um todo. Ocorrem ligações entre os átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da molécula Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:

O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma proteína é obtê-la de forma purificada. Geralmente a proteína que se deseja estudar é um componente minoritário (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras proteínas que estão presentes em qualquer tipo de tecido ou célula. Purificar uma proteína significa separar a proteína de interesse das outras presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio. Muitas vezes purificar uma proteína é a etapa limitante no estudo de suas características estruturais e propriedades biológicas. Em uma próxima aula estudaremos os métodos disponíveis para purificação de uma proteína

A proteína pura é tratada com Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica. aminoácido Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos. Tempo de retenção (min) fluorescência A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar (hidrólise) as ligações peptídicas. A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido.

Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados: Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína. Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e proteômica.

ciclo 1 ciclo 2 hidrólise com ácido trifluoroacético hidrólise ácida vai para novo ciclo análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa) (1) (2) (3) acoplamento Método de Edman - sequenciamento de proteínas com PITC (fenil-isotiocianato) Cada ciclo de reação compreende 3 etapas: Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K); Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S); Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína. Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.

Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman. Proteína Total 150 a.a sequência obtida a partir da proteína intacta 30 aa Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências. Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros. proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B

Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína. Na queratina (proteína da lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X. Para explicar esse padrão, foi proposto o modelo da a-hélice, com as seguintes caracterísiticas: esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta; o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina; as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice. Raio X Filme fotográfico a-hélice

Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura b para explicar o padrão de difração de raios X pela b-queratina, proteína presente na unha, chifres e cascos de animais. Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem pontes de H entre os átomos da ligação peptídica. As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha Vista lateral Folha anti-paralela -N C -C N Folha paralela -C N Pontes de H

antiparalela Paralela, torção à direita Paralela, torção à esquerda Folhas b paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica.

A a-hélice e a folha b são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica. Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do Ca. Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra b ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+. tipo 1 tipo 2 Dobra b “Zinc-finger” hélice-dobra-hélice

Beta-alfa-beta Só beta Só alfa Barril beta Barril alfa-beta A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula, chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos. Alguns modelos de organização estrutural, como os barris b e ab, aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.

Subunidade (uma cadeia polipeptídica) Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente ) Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente (pontes dissulfeto) ou não.

Algumas definições importantes: - Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural. Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos. Os termos conformação e configuração não são sinônimos. Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas L- e D- de um aminoácido. Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes. Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais. Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica.

Aminoácidos carregados Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Proteína NH — CH 2 OH ... O C Ponte de Hidrogênio Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 3 H + Ligação Iônica FORÇAS NÃO COVALENTES Pontes de H Aminoácidos polares Ligações iônicas Aminoácidos carregados Interações hidrofóbicas Aminoácidos apolares Forças de Van der Waals Qualquer aminoácido Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ?

entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não; Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Proteína NH — CH 2 OH ... O C Ponte de Hidrogênio Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 3 H + Ligação Iônica Pontes de H ocorrem: entre os átomos da ligação peptídica (por exemplo, a a-hélice e a folha b); entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não; para os grupos –NH3+ e –COO- dos aminoácidos N- e C-terminal, respectivamente. Ponte de Hidrogênio

dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do pH do meio; Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Proteína NH — CH 2 OH ... O C Ponte de Hidrogênio Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 3 H + Ligação Iônica Ligações iônicas: ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos com cargas contrárias; dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do pH do meio; são menos frequentes do que as pontes de H. Ligação Iônica

Interações hidrofóbicas: Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Proteína NH — CH 2 OH ... O C Ponte de Hidrogênio Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 3 H + Ligação Iônica Interações hidrofóbicas: ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares; radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros; não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água; como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares é hidrofóbico. Interações hidrofóbicas

é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários; Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Proteína NH — CH 2 OH ... O C Ponte de Hidrogênio Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 3 H + Ligação Iônica Forças de Van der Waals é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários; dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido à órbita errática dos elétrons; pode envolver qualquer tipo de aminoácido; geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas, pois a aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos. e Forças de van der Waals

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína). Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol. O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia A B

A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H e interações hidrofóbicas. A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.) * O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade de energia necessária para rompê-la. Tipo de ligação Energia * ( Kcal/mol ) LIGAÇÃO SIMPLES LIGAÇÃO DUPLA O — H 110 C 170 104 N 147 P 100 146 99 120 N 93 LIGAÇÃO TRIPLA 84 83 S 81 PONTE DE HIDROGÊNIO 70 NH ...O 62 OH ... N 53 NH ... N 51 OH ... O 4 - 5 C C 195 A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC. A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativa- mente rara entre as proteínas. Por ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em meio ácido ou por calor. Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por pequenas variações do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas na estabilidade da conformação nativa.

As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na determinação de sua conformação. A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de a-hélices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.

Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido. O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso. Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido. O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica. Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo. O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.

Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactéria Halobacterium salinarum, é o sistema fotossintético mais simples conhecido, permitindo a sobrevivência do organismo em situações de baixo O2, ao converter luz solar em energia química. Quando a molécula de bR absorve um fóton, ela se torna uma bomba de prótons, bombeando H+ do meio intracelular para o exterior da célula. A energia do gradiente eletroquímico formado é então utilizada para síntese de ATP por uma ATP sintase. citoplasma meio externo canal de H+ Para ter esse tipo de estrutura, a proteína apresenta as cadeias laterais de seus aminoácidos apolares voltadas para “fora”, em contacto com os lipídeos da membrana da célula. Aminoácidos polares estão voltados para “dentro”, delimitando o canal de prótons da molécula. Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana

Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ? O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas. Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto. Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica, mostrando que voltou à sua conformação nativa. Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma. A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o que determina a estrutura 3D das proteínas.

De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ? Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão altamente organizadas ? De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ? entropia energia Estrutura nativa A conformação nativa de uma proteína representa o estado de menor energia do sistema. A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma proteína vem do aumento da entropia da água, representando “desorganização” da água à medida que interagem com a proteína. In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por chaperonas durante o processo de síntese proteica.

Utilize o programa RasMol para explorar a estrutura tridimensional de proteínas: Clique aqui para fazer o download do arquivo rw32b2a.exe. Salve-o numa pasta em seu computador. Faça o download dos arquivos .pdb da quimotripsina e da pepsina. Execute o RasMol (clique 2X no arquivo rw32b2a.exe) e abra os arquivos .pdb Explore as várias formas de visualização das proteínas.

Encerramos aqui a segunda aula da disciplina Biofísica de Proteínas. Níveis de organização estrutural das proteínas Modelos de estrutura proteica Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas No ED 2 aplicaremos vários dos conceitos aprendidos hoje.