Análises Bromatológicas PROTEÍNAS EM ALIMENTOS Profa. Ionara F. R. Vieira

PROTEÍNAS DEFINIÇÃO Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn). Polímero de alto peso molecular Unidade básica: aminoácidos IMPORTÂNCIA nutricional propriedades sensoriais

AMINOÁCIDOS (aa) PROTEÍNAS Unidades estruturais básicas das proteínas

AMINOÁCIDOS (AA) Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) característica, que influencia suas propriedades físico-químicas. Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica. Arranjo tetraédrico  atividade ótica  isômero L e D Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas naturais.

AMINOÁCIDOS (AA) Apolares ou hidrofóbicas, exemplos: leucina                                  alanina leucina fenilalanina valina triptofano metionina

AMINOÁCIDOS (AA) Polares ou hidrofílicos, exemplos: tirosina  ácido aspártico serina ácido glutâmico glicina asparagina histidina

PROTEÍNAS

PROTEÍNAS São polímeros de aminoácidos. Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente nas proteínas. Diferem com o tipo, número e seqüência de aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional. Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.

PROTEÍNAS ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS ESTRUTURA PRIMÁRIA Seqüência linear de aminoácidos Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula Varia em 3 aspectos: número, seqüência e natureza dos AA

PROTEÍNAS ESTRUTURA SECUNDÁRIA Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares

PROTEÍNAS ESTRUTURA TERCIÁRIA Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas Estabilização: Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da molécula

PROTEÍNAS ESTRUTURA QUATERNÁRIA Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc.

PROTEÍNAS NO ALIMENTO Fonte de aminoácidos na dieta e de energia. Aminoácidos essências (lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo organismo humano. Proteínas alimentares são digeríveis, não tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas moleculares, atributos nutricionais e propriedades físico-químicas.

PROTEÍNAS Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos. Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, freqüentemente determinam sua textura, por exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe.

PROTEÍNAS Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes. Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos, castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.

MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS IMPORTÂNCIA Conhecer o valor nutritivo Determinação da composição centesimal de um alimento e análise para rotulagem Estimar rendimento industrial Avaliar a qualidade (ex.: glúten  qualidade da farinha) Avaliar a influência nas propriedades sensoriais

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por nêutrons; ativação por prótons B. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia

Análise de nitrogênio É a determinação mais utilizada. Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio. Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%. %Proteinas = F x %N Fatores de conversão específicos: trigo- 5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.

Proteínas - Kjeldahl Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl. Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento. Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas. F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão.

KJELDAHL É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado. Tem alta precisão e boa reprodutibilidade. O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.

CHON (alimento)  (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1) Método Kjeldahl 1a etapa: Digestão O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim permanece na solução: CHON (alimento)  (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)

Método Kjeldahl (NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2) 2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia: (NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2) A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso. NH3 + H3BO3  NH4+ + H2BO3- (íon borato) (3)

Erlenmeyer com solução de H3BO3 DESTILADOR Água de arraste Amostra NaOH Erlenmeyer com solução de H3BO3 DIGESTOR

Método Kjeldahl 3a etapa: Titulação O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico. H2BO3- + H+  H3BO3 (4) A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio. O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado: %Protein = F x %N

Falhas do processo (Kjeldahl): 1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos. 3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos 5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes

DESTILAÇÃO DIRETA Modificação do método de kjeldahl. Sem digestão. Amostra + NaOH/Na2SO4  NH3 Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido. Necessita de curva de calibração. É usado como rotina em alguns alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).

Combustão da amostra (700º-800ºC) Método Dumas (1831) Também determina N total. Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2. O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental. N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final. Combustão da amostra (700º-800ºC) Medição do N gasoso

Equipamento - melhora precisão; Método Dumas Necessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F. Problemas: sujeita à erros  pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa. Equipamento - melhora precisão; - mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl; - não necessita de reagentes ou catalisador.

Precipitante + proteína  turbidez Turbimétrico Fundamento: medida da turbidez causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico. Precipitante + proteína  turbidez Mede-se o grau de turbidez. Rápido, simples (proteínas líquidas). Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.

Métodos Espectrofotométricos As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas. A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração. As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida.

Métodos espectrofotométricos UV e visível Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas. Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho. Absorbância depende do tipo de proteína.

Teste do Biureto (Riegler, 1914) Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas. Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro. Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm. Determina proteínas.

Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.

B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry) Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas). Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul. Cor azul  colorímetro (500 a 750 nm)  curva padrão.

B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry) Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de incubação Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida Intensidade da cor depende de cada proteína.

C. Métodos Espectofotométricos UV Princípio - proteínas possuem absorção UV em 280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina. Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo. Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos. Ácidos nucléicos podem interferir.

Corante ligado = corante inicial – corante livre. Método Dye-binding Corantes que reagem quantitativamente com proteínas. Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H. Corante + proteína  complexo insolúvel. Mede-se o excesso de corante colorimetricamente. A quantidade de proteína : Corante ligado = corante inicial – corante livre. Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.

Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico. DYE-BINDING Fundamento: Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico. Desvantagens: Aquisição do equipamento Amostra + corante (exc.) Formação de um complexo insolúvel Separação (centrifugação ou filtração) Mede o excesso de corante que não reagiu Por diferença obtém-se a quantidade de proteína

SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS Solubilidade Cromatografia: - tamanho, - carga, - adsorção.

Análise de aminoácidos Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas. A proteína é hidrolisada  usando um ácido forte ou enzimas  libera aminoácidos. Cromatografias separam os aminoácidos  troca iônica, afinidade ou por absorção.