QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

AMPLIFICAÇÃO

RT-PCR semi-quantitativa Diluição seriada do cDNA 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...

Amplificação na maior diluição corresponde a uma cDNA em concentrações decrescentes 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Amplificação na maior diluição corresponde a uma maior quantidade de cópias do gene na amostra

SISTEMA DE DETECÇÃO

SYBR® Green Intercalante de DNA dupla fita Fluoróforo em suspensão Inespecífico Curva de dissociação ou melting Não permite multiplex

Curva de dissociação Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação Realizada ao término da termociclagem

Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia Sistema TaqMan® Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease Trabalha com sondas que contém fluoróforos Específico Permite Multiplex Não necessita curva de dissociação Sonda: Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia

R Q 5’ 3’ R 5’ 3’ Q R Q

R Q R Q

Características da sonda Localiza-se de 1 a 5 pb do primer Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers A primeira base não pode ser G (Quencher) Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)

Condições de Amplificação Condições Universais para desenho dos oligos: - Amplicon de 50 a 100 pb Conteúdo de GC Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C Condições Universais de Termociclagem: Desnaturação Anelamento e Extensão Uracil-N-Glicosilase Ativação da AmpliTaq Gold

Terminologia Baseline Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não ultrapassa a intensidade da fluorescência encontrada no meio.

Terminologia Threshold Nível de fluorescência onde a reação é detectada durante a fase exponencial; linha de comparação entre as amostras Threshold

Terminologia Cycle Threshold (CT) Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza o limiar de detecção (Threshold) Cycle Threshold (CT)

Terminologia Rn Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva (sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir erros de pipetagem

TIPOS DE QUANTIFICAÇÃO Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento Músculo Pele Neurônio + + + + + + + + + + + +

Custom TaqMan® Gene Expression - Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações. TaqMan® Gene Expression Assays - Kit pronto disponível (genes conhecidos) TaqMan® Endogenous Control - Kit pronto disponível

CONSIDERAÇÕES FINAIS Custo-benefício Conhecimentos específicos Validação de resultados Interpretação estatística

RELATÓRIO: Aplicações diagnósticas de PCR em tempo real , genética, oncologia, virologia, parasitologia etc...